一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，该疫苗具有较好的免疫原性。本发明专利技术所提供的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，是将ORF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到的重组质粒。本发明专利技术所提供的锦鲤疱疹病毒核酸疫苗对于鲤鱼疱疹具有有效的预防作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种锦鲤疱疹病毒核酸疫苗，属生物

技术介绍
锦趣抱疫病毒病(Kio herpesvirus disease, KHVD)是由锦趣抱疫病毒(Kio herpesvirus, KHV)引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种如框镜鲤等发病的一种具有高度传染性和致死性的疾病。该病于1998年首次在以色列的Magan Michael地区和美国爆发，2000年该病传至英国、德国和比利时；2002年4月，印尼发生本病，同时中国广东省锦鲤疑似发生本病；同年12月我国台湾省证实锦鲤感染本病；2003年10月日本证实该病已在本国存在。目前， 该病在我国的鲤鱼养殖中发病较多，造成鲤鱼的大量死亡，给鲤鱼养殖业带来了几乎毁灭般的打击。尽管有多种传统疫苗可用于疾病的免疫预防，但在生产实践中以及我们的试验研究结果均表明，利用灭活苗来免疫预防锦鲤疱疹病毒病不能起到完全免疫保护作用，同时在我国尚未见有分尚出或研究出KHV弱毒株病毒的报道，因此亟待有该病毒的新型疫苗问世。核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)又称基因疫苗、DNA疫苗，它是利用DNA重组技术将保护性抗原蛋白基因克隆到真核表达载体，并将其直接导入体内，使抗原蛋白内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。0RF25基因表达糖基化蛋白，基因大小849bp，编码282个氨基酸，具有信号肽切割位点，表达蛋白主要存在于细胞质，是KHV主要的结构蛋白基因，诱导产生中和抗体作用，具有良好免疫原性。本专利技术以0RF25基因为目的基因，pIRES-neo为真核表达载体，构建了 pIRES_0RF25真核表达重组质粒，并研究其免疫效力，研制出高效、新型KHV核酸疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有良好免疫原性的锦鲤疱疹病毒0RF25核酸疫苗。本专利技术所提供的锦鲤疱疹病毒0RF25核酸疫苗，是将0RF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到pIRES_0RF25重组质粒。其中，所述0RF25基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No. I所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。本专利技术利用将编码锦鲤疱疹病毒的0RF25基因定向克隆到真核表达载体 pIRES-neo中，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒DNA经限制性核酸内切酶鉴定证实含有正确的0RF25基因。用SDS碱裂解法大量提取质粒，通过罗氏FuGENE HD转染试剂将重组质粒导入框镜鲤尾鳍细胞(MFC)内，收集转染48小时后的MFC细胞，用 ffestern-blot方法检验目的基因的蛋白表达情况,证明所构建的真核重组表达质粒成功在 MFC细胞中得到了表达。重组表达质粒进行肌肉注射健康鲤鱼，每14天免疫一次，共免疫 3次，每周心脏采血，利用ELISA方法检测鲤鱼血清中的KHV特异性抗体。用0RF25重组质粒免疫的鲤鱼血液中可检测到KHV的特异性抗体，加强免疫后抗体水平随免疫次数的增加而增高。采用固定病毒稀释血清方法，测定0RF25重组质粒免疫后各试验组鲤鱼血清中抗 KHV中和效价，0RF25重组质粒免疫组鲤鱼血清均产生了明显的中和抗体。第三次免疫后两周用IOOTCID5ci的KHV对各组鲤鱼胸腔攻毒，免疫后的鲤鱼保护率显著提高。对每组鲤鱼进行病理切片，显示免疫鲤鱼大大提高了感染后腮、肾、脾、肝的病理状况。其中，本专利技术所用锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)和框镜鲤尾鳍原代细胞 (MFC)均由吉林农业大学动物科技学院实验室保存提供。本专利技术的有益效果本专利技术的锦鲤疱疹病毒0RF25核酸疫苗容易生产，在大肠杆菌中可高效克隆；稳定性强，可在大肠杆菌中长期严格复制克隆；在鱼体内使用安全，由于是真核载体表达保护性抗原所以不会造成病毒扩散；免疫剂量小，所专利技术的核酸疫苗对鲤鱼进行免疫后，载体高效表达，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外，所以免疫剂量极小。本专利技术的核酸疫苗目前已在鲤鱼上进行试验，取得了非常明显保护效率。如果用该疫苗免疫鱼，必将大大减少鱼患锦鲤疱疹的患病机率，保证鱼的产量和质量。本专利技术能使鱼建立针对锦鲤疱疹病毒病有效的抗病机制，使养殖户减少经济损失。同时减少药物使用量，从而保证水产品的质量，维护生态稳定性。使用本专利技术具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。附图说明图I :锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)的0RF25基因PCR扩增电泳图，其中M为 DNA分子质量标准，I为0RF25基因PCR产物；图2 :重组质粒pIRES-0RF25的PCR鉴定结果，其中M为DNA分子质量标准，I为重组质粒PIRES-0RF25的PCR结果，2为阳性对照，3为阴性对照；图3 :重组质粒pIRES-0RF25的双酶切分析电泳图，其中M为DNA分子标准质量，I 为pIRES-0RF25的酶切结果；图4 :含pIRES-0RF25表达载体的MFC细胞表达蛋白的Western-blot分析结果， 其中M为蛋白Marker, I为pIRES_0RF25转染组，2为阴性对照；图5 :用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼腮组织的显微切片(X 100)，其中 A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES_0RF25的免疫组；图6 :用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼肾脏组织的显微切片(X100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES_0RF25的免疫组；图7 :用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼脾脏组织的显微切片(X 100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES_0RF25的免疫组；图8 :用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼肝脏组织的显微切片(X 100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES_0RF25的免疫组。图9 :真核表达载体pIRES-neo的物理图谱具体实施方式实施例I :0RF25基因的克隆与鉴定I.设计0RF25基因扩增引物根据GenBank上已登录的KHV-I株0RF25基因序列，利用软件Primer Premiers 5. O设计引物，上游引物为F1 5 ; -GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3 '，下游引物为F2 5' -GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'，分别引入EcoR V和EcoR I两个限制性酶切位点(划线部位)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2. 0RF25基因的PCR扩增与鉴定以KHV核酸DNA为模板，对0RF25基因进行PCR扩增。反应体系为F1，F2 (20pmol/ μ L) O. 5 μ L> 10 X ExBuffer 2· 5 μ L、dNTP 2 μ L、DNA I μ L、ExTaq 酶 O. 25 μ L、加灭菌水补足至25 μ L。PCR反应条件为:预变性95°C，5min ;变性94°C，40s ;退火59. 3°C，30s ;延伸 72°C, Imin0扩增循环数均为35次；最后，反应体系于72°C总延伸lOmin，反应结束后4°C保存。取5 μ L PCR产物，在I X TAE缓冲液中以DL 2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，其特征在于，是将ORF25基因克隆到真核表达载体pIRES?neo中得到pIRES?ORF25重组质粒。

【技术特征摘要】
1.一种锦鲤疱疹病毒0RF25核酸疫苗，其特征在干，是将0RF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到pIRES_0RF25重组质粒。2.根据权利要求I所述的锦鲤疱疹病毒0RF25核酸疫苗，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：周井祥，张东鸣，王好，李新伟，张伟，祖岫杰，杨春桥，郭海勇，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：