本发明专利技术涉及医药和基因技术领域，特别是用于预防和治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型感染疾病的一种单纯疱疹病毒Ⅱ型ＤＮＡ疫苗。本发明专利技术通过分子生物学手段，将单纯疱疹病毒Ⅱ型的糖蛋白Ｄ基因组合到含卡那抗性的真核表达载体ｐＫａｎ中，构建包括含全长的糖蛋白Ｄ基因的真核表达质粒ｐｇＤ和含ＣｐＧ基序的真核表达质粒的ＤＮＡ疫苗。这种ＤＮＡ疫苗免疫机体可产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，它包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含CpG基序的真核表达质粒pCpG。 真核表达质粒pgD由真核表达载体pKan和插入其中的单纯疱疹病毒II型糖蛋白D基因组成。真核表达载体pKan为pcDNA3中的Amp+基因片断被Kan基因片段所取代后构建的载体。真核表达载体pCpG由真核表达载体pKan和插入其中的3-10个CpG基序组成。全长的糖蛋白D基因来源于单纯疱疹病毒II型毒株。 本专利技术首先构建了具有卡那霉素抗性基因的真核表达载体。本专利技术设计的载体具有以下几个特点(1)采用卡那霉素抗性基因，避免使用氨卞青霉素抗性基因带来的对过敏人群的潜在危害性；(2)含有质粒复制子、多克隆位点和真核表达调控必需元件(包括启动子、增强子、转录终止信号)。本专利技术设计一对引物从质粒pET-28a(+)上通过PCR扩增获取kan+基因片断，设计第二对引物从质粒pcDNA3上通过高保真PCR获取除Amp+基因片断以外的全部质粒片断。将得到的两个PCR产物连接重组获得新型真核表达质粒载体pkan。 本专利技术插入的外源基因来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，其结构描述如下所示 (1)序列特征 长度1314bp 类型核酸 链数双链 几何结构线性 (2)分子类型DNA (3)来源单纯疱疹病毒II型sav株，购自中国科学院病毒听。 (4)序列描述如序列表所示。 本专利技术合成了含有3-10个CpG基序的片断，通过多克隆位点插入到自己构建的新型真核表达载体pkan中，获得pCpG。 本专利技术从单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因中获取全长的gD基因克隆自己构建的新型真核表达载体pkan中，获得pgD；由真核表达载体pkan和插入其中的3-10个CpG基序获得pCpG；按不同比例混合组成DNA疫苗。该疫苗可诱导机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染，解决单纯疱疹病毒II型感染反复复发的严重问题。 本专利技术的有益效果本专利技术具有预防和治疗作用的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，DNA疫苗由于具有多肽疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效性，DNA疫苗具有诸多传统疫苗没有的优越性，它能激发机体同时产生持久的体液和细胞免疫，制备简单且纯度很高，进入体内后既不插入染色体，DNA也不复制，因而比较安全。 附图说明 图1真核表达质粒载体pKan的构建图谱 图2真核表达质粒载体pKan酶切鉴定结果 1.100bp DNA Ladder Plus 2.pKan/Ssp I 3.pKan/Bgl II and Xho I 4.pKan 5.PCR得到的kan+基因片断 6.PCR得到的质粒长片断 图3Balb/c小鼠第三次免疫后血清ELISA检测IgG结果 图4Balb/c小鼠经免疫接种后流式细胞仪检测CD4+、CD8+结果 图5Balb/c小鼠经免疫后攻毒结果 具体实施例方式 实施例1新型真核表达载体pkan的构建 1.引物设计 (1)设计第一对引物从质粒pET-28a(+)上通过PCR扩增获取kan+基因片断上游引物P1 5’GCCCTTAAGATGAGCCATATTCAACGG 3’(下划线处为Af1 II酶切位点)； 下游引物P2 5’AGTCCGCGGTTAGAAAAACTCATCGAG3’(下划线处为Sac II酶切位点)； (2)设计第二对引物从质粒pcDNA3上通过高保真PCR获取除Amp+基因片断以外的全部质粒片断 上游引物P3 5’GCGGCTTAAGACTCTTCCTTTTTCAAT 3’(下划线处为Af1 II酶切位点)； 下游引物P4 5’ATACCGCGGCTGTCAGACCAAGTTTAC 3’(下划线处为Sac II酶切位点)；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 2.PCR扩增 (1)以质粒pET-28a(+)为模板进行PCR扩增，获得两端分别具有Af1 II和Sac II酶切位点的kan+基因片断(约810bp)。反应体系及条件如下 反应体系 10×PCR Buffer for Taq10μl Mgcl2 8μl 10mM dNTP 8μl 20μM P1 Primer 2μl 20μM P2 Primer 2μl pET-28a(+)(1∶100稀释)3μl Taq酶 1μl 无菌双蒸水66μl 100ul 反应条件 94℃30s，54℃40s，72℃1min，30次循环后，72℃延伸10min。 PCR产物经1.5％琼脂糖电泳分析鉴定确认后，进行NH4AC沉淀(1VOL PCR产物+1/4VOL 10M NH4AC+2.5VOL无水乙醇，室温沉淀15min，室温13000rpm5min离心，去上清70％酒精洗涤，室温13000rpm 3min离心，去上清65℃烘干)。沉淀溶于100μl双蒸水中，得到PCR1。 (2)以质粒pcDNA3为模板进行高保真PCR扩增，获得两端分别具有Af1 II和SacII酶切位点的除Amp+基因片断以外的全部质粒片断(约4580bp)。反应体系及条件如下 反应体系 10×PCR Buffer for Taq plus 10μl 10mM dNTP8μl 20μM P3 Primer 2μl 20μM P4 Primer 2μl pcDNA3(1∶100稀释) 3μl Taq plus酶 1μl 无菌双蒸水 74μl 100ul 反应条件 94℃45s，54℃45s，72℃6min，30次循环后，72℃延伸10min。 PCR产物经1.5％琼脂糖电泳分析鉴定确认后，进行NH4AC沉淀(1VOL PCR产物+1/4VOL 10M NH4AC+2.5VOL无水乙醇，室温沉淀15min，室温13000rpm5min离心，去上清70％酒精洗涤，室温13000rpm 3min离心，去上清65℃烘干)。沉淀溶于100μl双蒸水中，得到PCR2。 3.连接重组获得新型真核表达质粒载体pkan (1)用限制性内切酶Af1 II和Sac II分别对两个PCR产物进行双酶切，反应体系及条件如下 PCR1 60μl PCR260μl 10×酶切buffer8μl10×酶切buffer 8μl Af1 II2μlAf1 II 2μl SacII 2μlSacII 2μl H2O 8μlH2O 8μl 80ul80ul 37℃水浴酶切4hr。 (2)酶切产物进行NH4AC沉淀，然后分别溶于50μl双蒸水中。 (3)用T4DNA连接酶对酶切产物进行连接。 PCR1 5μl PCR2 10μl 10×buffer for T4 DNA ligase 3μl T4 DNA ligase 1μl H2O11μl 30ul 4℃连接过夜。 4.大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)用无菌接种环蘸取大肠杆菌菌株培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型单纯疱疹病毒Ⅱ型ＤＮＡ疫苗，其特征在于包括含全长的糖蛋白Ｄ基因的真核表达质粒ｐｇＤ和含ＣｐＧ基序的真核表达质粒ｐＣｐＧ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪艳，陈勇，何方，杨连华，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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