本发明专利技术涉及表达外源基因的重组猪细小病毒（ＰＰＶ）ＶＰ２病毒样粒子的构建及应用，属于基因工程疫苗领域。将ＰＰＶＶＰ２基因的Ｃ端基因片段克隆于人５型腺病毒穿梭载体，获得重组腺病毒ｒＡｄ－ΔＶＰ２，ΔＶＰ２蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子［ＰＰＶ：ＶＬＰｓ］。以ＰＰＶ ＶＰ２病毒样粒子作为抗原转运载体，将２型猪圆环病毒核衣壳蛋白（Ｃａｐ）基因嵌合在ＰＰＶ ＶＰ２基因的Ｎ端，获得重组腺病毒ｒＡｄ－ΔＣａｐ－ΔＶ Ｐ２。嵌合的ＶＰ２（ΔＣａｐ－ΔＶ Ｐ２）蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子［ＰＰＶ：ＶＬＰ（ＰＣＶ２）］。本发明专利技术还涉及该重组病毒及其表达外源基因的重组ＰＰＶ ＶＰ２病毒样粒子在疫苗免疫等方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在腺病毒表达系统中表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV) VP2病毒样粒子的构建 及应用，属于基因工程疫苗领域。二
技术介绍
PPV (Porcine Parvovirus)不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，而且能够引起多种猪病。 VP2是病毒粒子主要成分，约占80%，在自然状态下可自主装配。VP2具有良好的免疫原性，众多的 科学家利用VP2的良好免疫特性构建重组疫苗来预防本病，取得了很好的效果，同时还是具有血凝活 性的物质。Martinez等将PPVVP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达， 表达的VP2多肽能自我装配成病毒样粒子(Virus-Like Particles, VLPs)，用其免疫母猪能诱导产生免疫 应答。尽管未见有关该种疫苗进一步研究和应用的报导，但是VP2基因在体外表达的蛋白能自我包装 成病毒样粒子的特性，为重组多价亚单位疫苗的研究打下了基础。Sedlik等将PPV VP2和包含淋巴细 胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体 PACYM，转染表达PPV:VP2-LCMV蛋白。利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内 持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。之后，Sedlik又将LCMV的CD8+T细胞抗原 决定簇多肤共价结合于l nm的脂质微球上，与上述表达的PPV:VP2-LCMV蛋白一起进行了免疫小鼠 的比较，结果发现二者都能诱导产生很强的CD8+T细胞反应。但是PPV:VP2-LCMV携带的抗原量比 脂质体微球少100倍时，诱导的CTL活性仍比脂质体微球诱导的CTL活性高6倍，并且只有 PPV:VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒 HBSAg的抗原决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生了很强的针对插人的HBSAg决定簇的T细胞反 应，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻击。这些结果均说明PPVVP2病毒样粒子作为一种抗原的转运载体 具有很大的潜在价值，并为进行多价重组疫苗的研究创造了良好的条件。猪圆环病毒2型(PCV2)与多种猪病相关，主要引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综 合征(PDNS)、繁殖障碍、猪呼吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、也可能引起渗出性皮炎、 仔猪先天性震颤等。尤其PMWS，自1991年加拿大首次报道以来，现已证实呈世界性流行,我国的一 些猪场也普遍存在本病。大量报道证明易感猪单独感染PCV2后会出现典型的病理变化，但不表现或 只出现轻微的临床征状，但在感染其他病原如PPV、 PRRSV、各种致病菌等、饲养条件改变或外界刺 激条件下表现临床征状。PCV2与PPV和PRRSV混合感染引起的PMWS很难治愈，国外研究表明在 实验条件下PCV2与这两种病毒混合感染可以复制出典型的PMWS,但单独感染这三种病毒不表现临 床征状,因此有人认为PCV2与其他病原可能有协同作用，但其机理还不清楚。猪一旦感染圆环病毒病， 无有效治疗的药物，因此研究安全、有效的疫苗是预防本病的主要途径。已有研究表明PCV2 Cap蛋 白成为疫苗研究的候选基因，PCV2抗原决定簇主要集中在Cap蛋白第47 85， 165 200及C端最后 4个氨基酸。三、发现内容技术问题本专利技术目的在于1)利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子的方法， 及以该重组PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体进行多价重组疫苗的研制；2)构建了在腺病 毒表达系统中表达2型猪圆环病毒Cap基因的重组PPV VP2病毒样粒子及其在疫苗上的应用。技术方案表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV) VP2病毒样粒子，其特征在于，是利用腺病毒表达系统 表达PPVVP2C端1640bp基因片段AVP2构建而成的PPVVP2病毒样粒子。构建方法为1) 获取AVP2目的基因并克隆入pMD9-T载体以GenBank中基因登录号为NC:001718的NADL-2菌株基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物P1 5 '-gaggtaccgggggggttggt卿國3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'分别加入ATp"I和Afe/1酶切位点，以PI, P2引物扩增PPV弱毒株NADL-2的DNA,扩增的PCR 产物含VP2基因1740 bp中的1640 bp片段AVP2，在1%琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化￡.co//DH5a，碱裂解法提取质粒，《p71和Afort双酶切鉴定，获得阳性质粒pTAVP2;2) 重组质粒pAd-AVP2的构建与鉴定利用双酶切位点A^ I/AtoI将目的片段克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中；用A:/7wIM^ I双酶切及 测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-AVP2;用尸附e I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与pAdEasy mVector在1.8 kV、 25 和200 Q条件下电转化至大肠杆菌A/57W感受态细胞，使rShuttle-AVP2 与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5(x宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR，酶切鉴定 重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-AVP2;3) 重组PPV VP2病毒样粒子的获得将重组质粒pAd-AVP2转染转染HEK-293A细胞，获得重组腺病毒pAd-AVP2，重组腺病毒表达 的AVP2蛋白在该重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLPs，即为构建 的在腺病毒表达系统中表达外源基因的重组PPVVP2病毒样粒子。上述重组PPVVP2病毒样粒子作为抗原转运载体的应用所获得的产品，其特征在于，将表达2型 猪圆环病毒PCV2 Cap的165-200位氨基酸基因(ACap)嵌合在PPV VP2病毒样粒子AVP2的N端，然 后克隆到腺病毒表达系统中所获得的病毒样粒子或疫苗产品。有益效果本专利技术的特点和优点如下1、 本专利技术应用的腺病毒表达系统是缺失了El和E3基因的人腺病毒血清5型(Ad5)，具有无致病 性、复制效率高、克隆空间大(可容纳7.5 Kb的外源片段)、能在大多数哺乳动物细胞和组织中表达重 组蛋白、在同种细胞和组织中可同时表达多个基因等特点，可对外源基因进行正确的翻译和修饰，使 表达的蛋白具有与天然蛋白相同的生物活性。使用该系统构建的重组病毒用于猪体，还可以避免由于 猪体自身产生的腺病毒抗体影响免疫效果。2、 利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPVVP2病毒样粒子将PPVVP2C端基因片 段AVP克隆到腺病毒表达系统中，转染HEK-293 A细胞，RT-PCR、间接免疫荧光及Western-blotting 实验结果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A细胞中高效表达；表达产物的粗提物用3%的磷钨酸负染后 经透射电镜观察，在电镜下可以看到大量病毒样颗粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大 小均与全病毒粒子相似。3、 利用腺病毒表达系统构建了表达外本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达外源基因的重组猪细小病毒（ＰＰＶ）ＶＰ２病毒样粒子，其特征在于，是利用腺病毒表达系统表达ＰＰＶＶＰ２Ｃ端１６４０ｂｐ基因片段ΔＶＰ２而构建成的重组ＰＰＶＶＰ２病毒样粒子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何孔旺，潘群兴，温立斌，张雪寒，倪艳秀，俞正玉，郭容利，吕立新，茅爱华，肖琦，黄克和，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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