热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统及其用于表达胸腺素α1的方法技术方案

涉及一种基因工程，构建了包含蓝藻热休克基因ｇｒｏＥＳＬ强启动区、目的基因ＵＢＴα１、ｒｂｃＳ终止区和Ｋｍ标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统，并运用基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行转基因表达胸腺素α１，由于利用热休克基因ｇｒｏＥＳＬ的强启动子，易调控，经热诱导后能几十上百倍地加快转录，同时利用泛素融合技术，使目的基因Ｔα１得到高效表达，本发明专利技术工艺简单，可举一反三，具有很大的开发前景，为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程。蓝藻(Cyanophyte)又称蓝细菌(Cyanobacterium)，是一种特殊的微生物。蓝藻的基因组简单，除了裸露的染色体DNA外不含叶绿体和线粒体DNA，便于进行基因分析。近年来，已克隆了大量蓝藻基因，建立了一些蓝藻的基因转移系统以及外源基因表达系统。蓝藻作为表达外源基因的受体菌已取得了不少研究成果。Tandeau de Marsac(Mol.Gen.Genet1987，209296～298)以pUC303为载体在单胞藻Synechococcus sp.PCC7942(简称Synechococcus7942，其余藻名依此类推)中表达了原核生物芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因；Fukuda等(Biotech.Lett1994，161～6)在Synechococcus 7942中表达了植物的乙烯合成酶基因；Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci USA 1994，919685～9689)把合成的人过氧化物歧化酶基因(h-SOD)置于1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbc)的启动子下在Synechococcus 7942中表达，产物占总蛋白量的3％，并且有良好的胞内生物活性；Murphy(Appl.Environ.Microbiol1992，581650～1655)把枯草杆菌的cryIVD基因融合在Synechococcus sp.PCC7942的cpcB基因上表达，融合蛋白质的表达量高而且没有明显降解，并具有杀蚊效力；孙军等(生物工程进展，1994，14(6)39～42)在Anabaena 7120中表达了小鼠的金属硫蛋白基因(mt-1)。这些研究工作表明包括真核基因在内的外源基因能在蓝藻中表达。在目前的基因工程研究中，目的基因产物表达量一般可达细胞总蛋白量的20-30％。但存在一个问题，表达产物主要以无生物活性的包涵体形式存在，要得到活性产物必须进行体外折叠，成本高、得率低。而体内蛋白质折叠和装配须有其它蛋白质和酶参与，其中分子伴侣(Molecular Chaperones)就是非常重要的一种。它们是一类进化上很保守的蛋白质，广泛存在于原核与真核生物中，可催化、介导蛋白质特定构象的形成与稳定，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运。迄今为止，发现大多数分子伴侣属于热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)。热休克蛋白具有在热诱导后，细胞内大部分蛋白质的合成受抑制，而其则可过量表达的特性。Webb等(J.Bateriol1990，1725079～5088)对Synechococcus sp.PCC7942的热休克蛋白GroEL与GroES的基因克隆并测序，其序列如下-240 -200GCTTCGCGAGCGCGACAACTGTCAGGAGGGCGATTTTGCCACAGTCCAGCGTATCACCGAAGGCTGCACCTTCCCGCAGC-150AAGATTCCCATTCCTGCGATCGCCGAGTTCGGGAACCCGT“-35” “-100” “-10”ACTGAGGTCGCGTTGCCCTCCGAGAAGGCGGCCCGTACAT↓ -50TAGCACTCAGGTACTGGGAGTGCTAATCCATGCGGATCAT-1CCCGGTTGCCCTCTCCCCGTGACGACGTTTACTCAAAACT研究表明groEL与groES组成一个操纵子，经Southern分析表明该操纵子在染色体中为单拷贝，并经引物延伸实验鉴定出groESL的启动子区域。Ellis(Science，1990，250954～959)认为，由于热休克基因groESL的启动子属于强启动子，易调控，经热诱导后能几十上百倍地加快转录。同时根据热休克蛋白具分子伴侣的特性，如果外源基因产物与热休克蛋白同时表达，可以提高活性的外源蛋白产量。胸腺(Thymus)是免疫系统中重要的中枢器官，负责T细胞的分化和成熟，在抗感染、抗肿瘤和抗自身免疫性疾病中起着重要作用。从胸腺素混合物中分离出的胸腺素α1，是一个二十八肽，它可以预防免疫抑制病人感染条件致病菌，提高机体的细胞免疫能力，可用于治疗多种疾病如红斑狼疮、乙肝、艾滋病等，还可作为治疗某些癌症的辅助药物。现在胸腺素制剂已广泛应用于临床，但均是从猪、牛的胸腺中提取的多组分胸腺肽，提取时易混入猪、牛的某些蛋白，注射后可能导致人产生过敏反应。采用人胚胎提取的人胸腺素虽疗效不错，但人胚胎来源困难，难以形成规模生产。用多肽合成仪可合成胸腺素α1，但价格太贵。王震熙等(浙江医科大学学报，1989，18(3)106～109)把Tα1基因导入PWR590菌株，用SPA-ELISA改良法在转化的菌株中检测到Tα1的表达；Wetzel等(Biochemistry1980，196096～6104)根据Low和Goldstein(1979)确定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，与质粒pBR322连接后导入E.coli中表达，虽得到与天然Tα1活性相同的表达产物，但表达量低。本专利技术的目的旨在提供一种包含热休克基因groESL强启动区、目的基因，终止子及筛选标记基因的完整的可高效表达的蓝藻基因表达系统及以基因整合平台系统和穿梭质粒系统进行表达胸腺素α1的方法。下面为本专利技术的详细内容。一、蓝藻基因表达系统的构建根据Synechococcus sp.PCC7942 groESL操纵子中翻译起点ATG上游240bp片段两端的序列设计一对引物P1、P2P1 5′端引物5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠP2 3′端引物5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠ以蓝藻Synechococcus sp.PCC7942基因组DNA为模板，以P1和P2引物进行特异性PCR扩增得含groESL启动区的PCR扩增片段。用HindⅢ酶切含卡那霉素抗性基因Kmr)，MCS和rbcS polyA终止区的质粒pKYLX-71-35S，电泳回收4.9kb片段，与经同样酶切的pUC19连接重组，连接物转化E.coli JM101以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒pUCMT1’。根据胸腺素α1基因片段两端的序列设计一对PCR引物T1和T2T1(5′端引物)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠ BamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠ SpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’以常规PCR扩增法进行扩增后得110bp的Tα1 DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18质粒的SphⅠ/BamHⅠ位点之间所构建的质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328本文档来自技高网...

【技术保护点】
热休克诱导外源基因高效表达的蓝藻转基因表达系统，其特征在于根据蓝藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ７９４２的ｇｒｏＥＳＬ操纵子中ＡＴＧ上游２４０ｂｐ片段两端的序列设计一对引物Ｐ１、Ｐ２： Ｐ１ ５′端引物：５′－ＴＣＧＣ＊＊＊ＧＡＣＡＡＣＴＧＴＣ－３′ ＳａｃⅠ Ｐ２ ３′端引物：５′－ＣＣ＊＊＊ＴＴＴＴＧＡＧＴＡＡＡＣＧＴＣＧＴＣＡＣＧＧ－３′ ＳｐｈⅠ Ｐ２的５′端设计了一个ＳｐｈⅠ酶切位点，其切点为ＧＣＡＴＧ↓Ｃ；以蓝藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２基因组ＤＮＡ为模板，以ｐ１和ｐ２引物进行特异性ＰＣＲ扩增得含ｇｒｏＥＳＬ启动区的ＰＣＲ扩增片段；用ＨｉｎｄⅢ酶切质粒ｐＫＹＬＸ－７１－３５Ｓ，电泳回收４．９ｋｂ片段，与经同样酶切的ｐＵＣ１９连接重组，连接物转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１，以氨卞青霉素和卡那霉素筛选得重组质粒ｐＵＣＭＴ１’；根据胸腺素α１基因片段两端的序列设计ＰＣＲ引物Ｔ１、Ｔ２和Ｔ２’： Ｔ１（５′端引物）：５’－ＧＧ＊＊＊ＡＡ＊＊＊ＧＡＣＧＣＡＧＣＴ Ｓｐｈ Ⅰ ＢａｍＨ Ⅰ ＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＧＧ－３’ Ｔ２（３′端引物）：５’－ＧＧ＊＊＊Ｔ＊＊＊ＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡ Ｓａｌ Ⅰ Ｓｐｅ Ⅰ ＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴ－３’ Ｔ２’（３′端引物）：５’－ＧＧ＊＊＊ＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣ－３’ Ｓａｌ Ⅰ Ｓｐｅ Ⅰ 以常规ＰＣＲ扩增法进行扩增后得１１０ｂｐ的Ｔα１ ＤＮＡ片段；运用ｐＵＣ１８多克隆位点两端的通用引物Ｕ１和Ｕ２： Ｕ１（５′端引物）：５’－ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ－３’ Ｕ２（３′端引物）：５’－ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ－３’ 以质粒ｐＵＣＵＢ为模板，按常规ＰＣＲ方法扩增出含ＵＢ基因的３２８ｂｐ的ＤＮＡ片段；纯化ＵＢＤＮＡ片段和Ｔα１ ＤＮＡ片段，用ＢａｍＨⅠ同时酶切，然后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，以连接产物为模板，以Ｕ１和Ｔ２’为引物进行特异性扩增，得３８０ｂｐ的ＵＢＴα１ＤＮＡ片段；用ＳｐｈⅠ同时单酶切ｇｒｏＥＳＬ启动区的ＰＣＲ扩增片段和ＵＢＴα１ＤＮＡ片段，连接后以连接物为模板，Ｐ１、Ｔ２’为引物按常规ＰＣＲ法扩增后得ＥＳＬ－ＵＢＴα１片段，将ＥＳＬ－ＵＢＴ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：章军，徐虹，秦燕，楼士林，黄澜，李根，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]