重组水痘－带状疱疹病毒制造技术

本发明专利技术提供重组水痘－带状疱疹病毒及其制备方法，和包含重组水痘－带状疱疹病毒的药物组合物；还提供包含所述水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体、包含这种载体的细胞以及能与水痘－带状疱疹病毒进行同源重组的片段、包含所述的BAC载体序列的核酸盒。为此，本发明专利技术通过开发利用BAC载体序列制备重组水痘－带状疱疹病毒的方法，解决了上述课题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组水痘一带状疱疹病毒，特别是利用BAC (大肠杆菌人工染色体)制备的重组水痘一带状疱疹病毒，以及包含此种病毒的药物组合物。此外，本专利技术还涉及包含水痘一带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，以及包含此种载体的细胞。本专利技术还涉及制备重组水痘一带状疱疹病毒的方法。再有，本专利技术涉及包含能与水痘一带状疱疹病毒基因组进行同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。
技术介绍
水痘一带状疱疫病毒(varicella — zoster virus ;VZV)是属于人疱疫病毒科(Herpesviridae)的病毒，是表现出两种不同临床表象疾病(水痘和带状疱疹)的病因。这种病毒的初期感染弓I起水痘(水疱疮)。其后，此种病毒潜伏感染神经节，经年累月后由于某种诱因重新活化引发带状疱疹(形成病毒颗粒，通过神经传导，达到表皮细胞，在神经分布的区域形成水痘症状)。VZV基因组是双链DNA，包含约125000个碱基。全部的碱基序列已由Davison等人确定，已知该基因组中至少存在着72个基因。VZV疫苗的研发困难重重。VZV疫苗Oka株是由高桥等人开发的(特公昭53 —41202号)，是世界上唯一针对水痘一带状疱疹病毒的疫苗。现有的减毒活水痘疫苗是利用以来源于减毒水痘病毒Oka株的病毒作为种子制备的，目前在世界各国广泛应用(Requirements forVaricella (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 TechnicalReportSeries, N0.848, pp.22 — 38,1994)。这一 Oka株是由如下方式获得的，即将从表现典型的水痘症状的患儿分离的病毒(Oka原株)，利用人胎儿肺细胞在34°C下传代12代，再利用豚鼠胚胎细胞传代11代，然后利用人二倍体细胞传代数代来获得。所述的Oka原株虽然具有强病源性，但Oka疫苗株(Oka株)即使对正常的儿童接种也几乎没有发现副作用。因此，Oka株作为几乎没有病源性的疫苗株是有用的。病毒疫苗在进行传代培养时有可能改变其基因型。另外，由在Oka株自身的制备过程中经过多次传代培养，Oka株自身也可能具备遗传多样性。实践中，为了确保疫苗的安全性和有效性，考虑到在制备疫苗过程中，由于传代培养所导致的疫苗遗传改变，制定了种子批次系统作为对认可进行生产的水痘种子病毒的传代数的限制，即以确认种子时的传代数为O代，并把从O代开始总传代数在10代以内的病毒用作疫苗。另一方面，通过水痘疫苗的效果追踪，以及售后调查(PMS:post — marketingSurveillance)，从流行病学的观点，有必要对从自然感染的水痘患者分离的水痘病毒的新鲜野生株与来自上述Oka株的疫苗株之间的病毒学差异进行分析，故已进行了应用免疫学和遗传工程学进行分析的多种尝试。例如，已有基于下述文献进行的试验报道，即水痘病毒株间基因结构、DNA喊基序列之间的差异(Journal of GeneralVirology, 59,660 一 668,1986 ;同前 67，1759 — 1816，1986)，限制酶 Pst I 酶切位点的有无(Japanese Journal ofExperimental Medicine, 59，233 一 237，1989)，根据应用 PCR(聚合酶链式反应)进行的 RFLP(限制性片段长度多态性)判定(Journal of Virology,66,1016 一 1020，1992)，以及将上述Pst I 酶切位点的有无与 RFLP 分析相结合(Journalof Clinical Microbiology, 33,658 —660,1995).尽管通过这些试验提出了为鉴别新鲜的野生型菌株与来自Oka株的疫苗株的条件，但考虑到Oka株自身的遗传多样性的问题，仍缺乏可信性，且不具备确定性，故而仍然存在疫苗的品质管理问题。再有，已知有利用水痘病毒的基因14区域鉴定水痘病毒Oka株的方法(US Patent N0.6，093，535)，利用基因62区域鉴定减毒活水痘疫苗病毒株的方法(W0 00/50603)，这些方法中的任意一种技术均可以用于鉴定水痘病毒Oka株(强毒亲株)，由亲株衍生的疫苗株(减毒的Oka株)，以及Oka株之外的水痘病毒株之间的差异。但是以用于减毒活水痘疫苗的品质管理和品质保证的制剂标准尚不完备。目前，用于评定和确认疫苗品质的方法，还没有进行例如，通过对种子病毒和疫苗病毒的基因组DNA以直接的或定·量的遗传分析进行品质管理，因此用作活疫苗的减毒株的品质管理和品质保证的准确度无法计算，故而含混不清。因此，提高品质管理和品质保证的准确度对于确保减毒活水痘疫苗的有效性。安全性 均质性至关重要。然而，如上所述，由于尚未确立其方法，使其成为亟待解决的课题。此外，为了研制出一种优于Oka株的、经改变的水痘一带状疱疹病毒疫苗，也需要开发经诱变的重组水痘一带状疱疹病毒及其制备方法。专利文献1:特公昭53 — 41202号专利文献2:米国特许第6，093，535号专利文献3:国际公开番号WO 00/50603非专利文献1:Requirements for Varicella Vaccine (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 Technical Report Series, N0.848, pp.22-38,1994非专利文献2:Journal of General Virology, 59,660-668,1986非专利文献3:Journal of General Virology,67,1759-1816,1986非专利文献4Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237,1989非专利文献5 Journal of Virology, 66,1016-1020,1992非专利文献6:Journal of Clinical Microbiology, 33,658-660,199
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提高水痘带状疱疹疫苗的品质控制和品质保证的精度，以确保、保证减毒活水痘疫苗的有效性，安全性和均质性。此外，本专利技术的课题还在于为了研制一种优于Oka株的，经改变的水痘一带状疱疹病毒疫苗，建立通过诱变生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法，并提供此种病毒。为实现上述目的，本专利技术提供了重组水痘一带状疱疹病毒，及其生产方法，例如利用BAC (大肠杆菌人工染色体)由单一病毒株生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法。专利技术概述本专利技术人通过开发利用BAC载体序列制造重组水痘一带状疱疹病毒的方法，完成了本专利技术。本专利技术提供了下述内容。1.重组水痘一带状疱疫病毒。2.1项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，包含BAC载体序列。3.如2项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，至少部分BAC载体序列插入到水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中。4.如3项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域选自下述区域:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组、减毒水痘－带状疱疹病毒，其包含BAC载体序列，其中，至少部分前述BAC载体序列插入到水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中，并且其中，前述非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。

【技术特征摘要】
2004.03.05 JP 2004-0632771.重组、减毒水痘一带状疱疹病毒，其包含BAC载体序列，其中，至少部分前述BAC载体序列插入到水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中，并且其中，前述非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。2.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域。3.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中,所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。4.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。5.如权利要求4所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。6.如权利要求1所述 的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。7.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。8.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。9.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。10.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中,所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。11.包含权利要求1所述病毒的药物组合物。12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。13.载体，其包含水痘一带状疱疹病毒必需基因和BAC载体序列，其中，一部分BAC载体序列位于该水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。14.如权利要求13所述的载体，其进一步包含基因62。15.如权利要求13所述的载体，其中，当所述载体插入哺乳动物细胞时，哺乳动物细胞产生水痘一带状疱疫病毒。16.如权利要求13所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF与基因12的ORF之间的区域。17.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。18.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。19.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是药物选择标记。20.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。21.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。22.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。23.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。24.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。25.包含权利要求13所述载体的细胞。26.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是细菌细胞。27.如权利要求26所述的细菌细胞，其中，所述的细菌是大肠杆菌。28.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是哺乳动物细胞。29.如权利要求28所述的哺乳动物细胞，其中，所述的哺乳动物细胞来源于人。30.如权利要求28所述的哺乳动物细胞产生的病毒。31.包含如权利要求30所述的病毒的药物组合物。32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述的组合物是疫苗的形式。33.生产重组、减毒水痘一带状疱疹减毒病毒的方法，该方法包含以下步骤: 将含有水痘一带状疱疹病毒基因组必需基因与BAC载体序列的载体导入到哺乳动物宿主细胞中的步骤；和 培养所述的哺乳动物宿主细胞，生产重组水痘一带状疱疹病毒的步骤，其中，所述BAC载体序列位于该水痘一 带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：长池和宏，森康子，五味康行，高桥理明，山西弘一，
申请(专利权)人：财团法人阪大微生物病研究会，
类型：发明
国别省市：