本发明专利技术涉及能调控人类miRNA-21＊的重组腺相关病毒重组体(rAAV-miRNA-21＊/rAAV-anti-miRNA-21＊)的构建和制备方法，更具体地说涉及hsa-miR-21＊及反义序列hsa-anti-miR-21＊的克隆及含hsa-miR-21＊和hsa-anti-miR-21＊的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。hsa-miR-21＊长21nt，为非编码RNA，利用化学合成法构建pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊表达质粒，利用三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含目的片段的重组腺相关病毒并纯化，其中pAAV-D(+)-miR-21＊明显自发性高血压大鼠的血压水平、同时改善心脏功能。因此，确定含hsa-miR-21＊表达序列的重组腺相关病毒成为用于高血压及其他相关疾病的临床治疗药物的可能性。
【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及能调控人类miRNA-21＊的重组腺相关病毒重组体(rAAV-miRNA-21＊/rAAV-anti-miRNA-21＊)的构建和制备方法，更具体地说涉及hsa-miR-21＊及反义序列hsa-anti-miR-21＊的克隆及分别包含hsa-miR-21＊和hsa-anti-miR-21＊的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。 二、
技术介绍
microRNA(miRNA，miR)是一类新近发现的来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的内源性小分子非编码单链RNA，通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)特异性结合，促进靶mRNA降解，或者抑制靶mRNA翻译，降低编码蛋白质水平，从而实现对基因转录后的表达调控。microRNA与机体的多种疾病联系紧密，包括神经退行性疾病、糖尿病、肾病以及肿瘤等。近年来的研究发现，miRNA在心脏的生成、发育和功能方面均有着重要作用。 高血压是我国最常见的心血管疾病，可导致多种严重并发症，如慢性心力衰竭、慢性肾功能衰竭、脑中风等，导致社会经济负担加重。关于高血压的预防、诊断和治疗工作，目前仍存在巨大的不足，治疗率、控制达标率低，而致心脑血管疾病预防效果欠佳。 高血压病因和发病机制复杂，涉及多种效应器官和靶器官。目前世界卫生组织推荐的抗高血压药物有六大类：利尿剂、钙拮抗剂(CCB)、β受体阻滞剂、α1受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)，但尚不能达到让人满意的效果。miRNA参与许多重要病理生理过程，由于单一miRNA可调控多个靶基因的表达，因此针对疾病关键miRNA靶点的药物可参与多种信号通路调控，从而为高血压的防治带来新的希望。 近年来研究发现，miR-155对血管紧张素II-I型受体的调控作用可能是调控动脉血压的重要机制之一。而L-精氨酸转运子SLC7A1的3’UTR的多态性位点ss52051869与miR-122之间的调控关系与高血压之间的关系，并已在几个遗传性高血压家系中得到证实。但是目前为止尚未见关于miR-21＊在高血压中的作用及相关的治疗药物用途。 目前多采用腺病毒和慢病毒作为miRNA的表达载体，但腺病毒载体表达时间短、对机 体有免疫原性，慢病毒多由白血病病毒或HIV改造而来，生物安全性堪忧，均不适合将来的临床应用。而重组腺相关病毒载体(rAAV)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。为了真正实现高血压的基因治疗，我们将hsa-miR-21＊与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测获得满足治疗要求的高滴度，在动物实验中证实了其可以有效降低自发性高血压大鼠的血压水平，同时改善了心脏功能。因此，有希望成为用于临床高血压治疗的药物。 三、
技术实现思路
本专利技术人根据hsa-miR-21＊碱基序列，分别设计并合成了表达hsa-miR-21＊和反义互补anti-hsa-miR-21＊的序列，并成功分别插入真核表达载体pAAV-D(+)中构成重组质粒pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊。之后，将pXX9、phelper、pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能分别表达hsa-miR-21＊和反义互补anti-hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒，经纯化后，real-time PCR法测定滴度。下一步将包装制备的两种重组腺相关病毒(rAAV-miRNA-21＊和rAAV-anti-miRNA-21＊)分别经尾静脉注射至自发性高血压大鼠(SHR)，发现大鼠主动脉中hsa-miR-21＊的长期表达发生明显变化，说明重组腺相关病毒能介导hsa-miR-21＊/anti-hsa-miR-21＊的长期有效表达，从而促进/抑制血管hsa-miR-21＊的表达。并且发现SHR大鼠的血压受到明显调控，重组腺相关病毒能介导的hsa-miR-21＊表达明显减低大鼠的血压水平，并且改善心脏功能。而anti-hsa-miR-21＊则明显升高动物血压水平，进一步支持hsa-miR-21＊的降血压作用。 所以，本专利技术的第一个目的是提供分别含有hsa-miR-21＊和anti-hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒。 本专利技术的第二个目的是提供分别含有hsa-miR-21＊和anti-hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒的包装和制备过程。 本专利技术的第三个目的是提供利用分别含有hsa-miR-21＊和anti-hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒治疗和处理高血压的动物实验方法和主要结果。 四、附图说明摘要附图说明：不同MicroRNA治疗对SHR大鼠尾动脉血压的影响(＊表示与相同时间点control组相比，p＜0.05)。 说明书附图说明：从下面给出的说明结合附图，本专利技术的上面和其他目的和特征将变得明了。其中： 图1A显示了自发性高血压大鼠血压水平：尾动脉监测Wistar大鼠和SHR大鼠血压(*表示与相同时间点Wistar大鼠相比，p＜0.05)； 图1B自发性高血压大鼠主动脉中hsa-miR-21＊的表达情况：实验终点时，不同组别大鼠主动脉中hsa-miR-21＊的表达情况(＊表示与Wistar大鼠相比，p＜0.05)。 图2显示了hsa-miR-21＊的序列(取自miRBase)。 图3是显示pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊的质粒构成。 图4是纯化后的病毒转染细胞后荧光显微镜观察GFP(绿色显示的是转染成功的细胞)，其转染效率可达90％以上。 图5是real-time PCR检测不同处理的SHR大鼠主动脉中hsa-miR-21＊的表达情况(＊表示与control组相比，p＜0.05)。结果显示rAAV-miR-21＊和rAAV-anti-miR-21＊可明显调控SHR大鼠主动脉hsa-miR-21＊表达(前者升高hsa-miR-21＊表达水平，后者降低hsa-miR-21＊水平)。 图6A是SHR大鼠尾动脉血压情况：尾动脉血压监测明确不同MicroRNA治疗对SHR大鼠尾动脉血压的影响(＊表示与相同时间点control组相比，p＜0.05)，结果显示rAAV-miR-21＊可明显降低SHR大鼠尾动脉血压，而rAAV-anti-miR-21＊则明显升高动物血压。 图6B是SHR大鼠尾动脉心脏功能情况：Millar导管检测不同处理的SHR大鼠心脏收缩能力(＊表示与相同时间点control组相比，p＜0.05)，结果显示rAAV-miR-21＊可明显改善SHR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于高血压和/或由高血压导致的各种并发症的基因治疗的重组腺相关病毒，其特征在于：该载体系统包括包装质粒pXX9，辅助质粒phelper，真核表达载体pAAV？D(+)，并在真核表达载体pAAV？D(+)内分别插入了人类hsa？miR？21＊或anti？hsa？miR？21＊表达序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于高血压和/或由高血压导致的各种并发症的基因治疗的重组腺相关病毒，其
特征在于：该载体系统包括包装质粒pXX9，辅助质粒phelper，真核表达载体pAAV-D(+)，
并在真核表达载体pAAV-D(+)内分别插入了人类hsa-miR-21＊或anti-hsa-miR-21＊表达序列。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学
方法人工剪切、修饰和加工而成。
3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒为分别表达人类hsa-miR-21＊或
anti-hsa-miR-21＊的重组腺相关病毒，其特征在于：
1)pXX9：为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列；
2)phelper：为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了感染性复制所需序列，
它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；
3)pAAV-D(+)：真核表达载体，所用的是CMV启动子，有较强的表达效率，其含有多
克隆位点，可以连接不同的目的基因；本发明pAAV-D(+)分别连接hsa-miR-21＊和
anti-hsa-miR-21＊表达序列(pAAV-D(+)-miR-21＊和pAAV-D(+)-anti-miR-21＊)；该载体含有
rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带
目的基因。
4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒是分别表达hsa-miR-21＊和anti-hsa-miR-21＊的
重组腺相关病毒rAAV-miR-21＊和rAAV-anti-miR-21＊。
5.如权利要求1所述的重组腺相关病毒为分别插入重组腺相关病毒表达载体的人类
hsa-miR-21＊和反义anti-hsa-miR-21＊表达序列，其特征在于：该序列由人工设计、化学方法
合成。
6....
【专利技术属性】
技术研发人员：汪道文，陈琛，王峰，杨盛兰，马飞，
申请(专利权)人：汪道文，陈琛，王峰，
类型：发明
国别省市：
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