本发明专利技术涉及一种表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术构建了携带融合基因BDNF-HA2TAT的腺相关病毒载体BDNF-HA2TAT/AAV，表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒即可以分泌表达大分子蛋白BDNF，表达的BDNF又有穿过血脑屏障作用，同时将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF，解决了BDNF需反复给药的难题；通过抗抑郁效力筛选实验证明了可分泌表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒具有抗抑郁的作用，建立了一种有效预防和治疗抑郁障碍和应激障碍等精神疾病的手段和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种重组载体，具体地说，是ー种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法。
技术介绍
抑郁障碍存在海马神经元萎縮、细胞凋亡加速、神经元再生障碍等神经病理学改变。如何有效的保护海马神经元一直是抑郁障碍研究的热点和难点。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophi·c factor,BDNF)是神经营养因子家族中的重要成员，BDNF表达下调可能參与慢性应激所致抑郁症海马结构和功能的改变。将外源性BDNF注入强迫游泳和学习无助的抑郁大鼠模型的海马齿状回可以产生抗抑郁样活性，这说明BDNF中枢给药对于抑郁症来说是有效的。然而BDNF抗抑郁作用的发挥一方面有赖于其有效的中枢血药浓度，另ー方面中枢多次给药以及输注设备持久存在会引起神经组织的额外损伤。尽管外周静脉内给药简便、无损伤，但由于BDNF在血液循环中存在降解和血脑屏障的通透性问题，以致很难到达中枢神经的保护效应。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前发现的卩隹一无致病性的单链DNA病毒，也是已知的唯一能与人基因组特异染色体定点整合的天然复制缺陷病毒。它无明显的致病性，无免疫源性及炎症反应；不能独立复制，在无辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒)感染吋，AAV只能整合在宿主细胞的DNA中，呈潜伏感染状态，插入的外源基因表达时间长，转移外源基因时不伴随任何病毒基因的表达。AAV以点特异方式固定地整合在人19号染色体上，不存在致癌及插入突变；宿主范围广，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞(如神经元、肌细胞等)也较敏感。基于以上特点而开发的腺相关病毒载体是继腺病毒和逆转录病毒后出现的新型基因治疗工具。如果将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF。近年来，经鼻入脑的给药方式为国内外中枢神经系统给药方式研究的热点，这种给药方式既可以避免腹腔或静脉注射途径中需经血液循环入脑而引起的全身副作用，又可以避免在血液循环中降解过快，并且有着脑内药物浓度高的优点。以往的研究发现脂溶性好的小分子物质(小于IOkD)可以沿“鼻-脑”通路入脑，但大分子蛋白难以沿此通路入脑。由于在基因治疗中对神经系统有治疗作用的基因产物多为大分子蛋白，因此，寻求将大分子蛋白经“鼻-脑”通路导入脑内的方法，将为解决基因治疗的难题提供一种新的思路和方法。穿膜肽为近年来新发现的ー种具有蛋白转导功能的短肽，研究发现它的蛋白转导机制为新的非能量、非受体、非温度依赖的转导方法，常用的穿膜肽有果蝇的Ant蛋白、TAT蛋白人工合成的多聚精氨酸等。Murriel等通过腹腔注射穿膜肽2B2半乳糖苷酶，发现穿膜肽能携带该蛋白通过血脑屏障到达脑组织，同时能保持酶的活性，且在该过程中对神经细胞及血脑屏障的免疫反应很弱。上述实验均显示穿膜肽能够携帯蛋白质透过血脑屏障并保持蛋白的活性，同时对神经细胞、血脑屏障的免疫性很弱。中国专利文献CN1124343C公开了ー种由脑组织获得的神经营养因子，涉及编码了脑源神经营养因子(BDNF)的核酸序列以及用这些核酸顺序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物，还涉及BDNF蛋白质在制造治疗神经系统疾病或失调的药物中的用途。中国专利文献CN101078013A公开了神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用，克隆了人dok5的基因为治疗多种神经系统疾病提供了新的作用靶点，因此可用于开发神经系统疾病的药物。中国专利文献CN101302529A公开了共表达⑶NF和BDNF的转基因神经干细胞，描述了ー种构建共表达⑶NF和BDNF的转基因神经干细胞的方法及其用途和意义，为临床治疗神经退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中枢神经系统疾病提供了ー种转基因神经干细胞治疗新途径。王海珍等通过克隆人BDNF基因，构建含有TAT-BDNF的重组表达载体，为进ー步表达融合蛋白及探讨TAT携帯BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础(详见:王海珍等.BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重组表达载体的构建[J].神经损伤与功能重建，2008，3(5):304-306.)。李惠明等采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因，将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒PSNAV，然后用重组质粒pSNAV-1g-BDNF转染包装细胞，筛选出永久细胞株后，用携帯腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞，成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病·毒(详见:李惠明等.表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测[J].生物工程学报，2008，24(2):328-332.)。但是关于ー种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒。本专利技术的另ー的目的是，提供一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是:一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的: a、克隆BDNFcDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Coli DH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ； b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是:一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤: a、克隆BDNF cDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Cb7iDH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ；b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步骤a中B·DNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达BDNF?HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的表达BDNF?HA2TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：a、克隆BDNF?cDNA?融合基因，将?PCR产物连接入pGEM?T?Easy载体，获得的pGEM?T?Easy/BDNF转化受体菌E.Coli?DH5α，碱裂解法提取重组质粒?DNA；b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携带穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV?HA2TAT，构建重组载体质粒pSSCMV?BDNF?HA2TAT；c、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV?BDNF?HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒pFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF??HA2TAT的重组腺相关病毒。
【技术特征摘要】
1.一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的: a、克隆BDNFcDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Coli DH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ； b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。2.根据权利要求1所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：高成阁，马现仓，党永辉，杨广笑，李强，陈策，杨小波，郭丽阳，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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