本发明专利技术涉及调控病毒样颗粒(VLPs)，尤其是包括MS2VLPs上的肽展示效价的系统和方法。在该方法中，可以由单一RNA产生大量野生型和少量单链二聚体外壳蛋白。通过提供这样的系统来调控免疫原(疫苗)生产中的效价，所述系统使得可以由单一RNA产生大量野生型和少量单链二聚体外壳蛋白，从而能够在大范围内(从每个颗粒平均小于1到多达90个)灵活地调节VLPs，特别是MS2VLPS上的展示效价水平。这将有助于免疫原和疫苗，包括呈现低效价的VLPs的产生。本文公开了可用于表达病毒样颗粒的核酸构建体，所述颗粒由通过插入异源肽被改造的MS2外壳多肽构成，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上并包裹MS2mRNA。还公开了可用于表达病毒样颗粒的核酸构建体，所述颗粒由通过插入异源肽被改造的PP7外壳多肽构成，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上并包裹PP7mRNA。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在RNA噬菌体，特别是MS2和PP7的病毒样颗粒(VLPs)上进行肽展示的系统和方法。描述的方法和质粒载体用于协助构建高复杂度的随机序列和抗原片段文库，从而由其经亲和选择分离具有所需结合功能的肽。由于肽展示的密度是亲和选择严紧度的一个重要决定因素，还描述了用于控制VLPs上肽展示效价的方法和质粒。本专利技术的方法使得可以在大范围内灵活地调节VLPs，特别是MS2VLPS上的展示效价水平(即从每个颗粒上平均低于I到多达90)，从而促进免疫原和疫苗的鉴定和生产，包括展现低效价的VLPs。尽管该系统主要是为了疫苗开发而建立的，它在许多其他应用中也有用途，包括鉴定可用于细胞型或组织型特异性靶向递送药物和造影剂的肽-VLPs，和新材料的模板法合成。本申请描述了协助实施VLP展示系统的方法和质粒载体。专利技术提供了可用于病毒样颗粒的表达的核酸构建体，所述病毒样颗粒包含MS2或PP7的外壳多肽，各自经插入异源肽进行了改造，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上，并包裹着特定的RNA(MS2或者PP7的RNA)，后者引导VLP以及其上展示的肽的合成。还提供了相关的病毒样颗粒、方法和免疫原性组合物。
技术介绍
VLPs作为疫苗。近年来重组DNA技术的发展引领了疫苗的产生，其中免疫原性蛋白经过鉴定、克隆并在合适的宿主中表达以获得足够量的蛋白，从而在动物和人中达到有效的保护性免疫。最有效的疫苗中有许多是基于毒粒表面强有力引发中和抗体的能力。这包括已被许可的能够有效诱发保护性抗体反应的灭活或减毒病毒疫苗，比如脊髓灰质炎、流感和狂犬病疫苗。最近，Food and Drug Administration批准的亚基疫苗是基于人乳头瘤病毒(HPV)和乙肝病毒(HBV)的结构蛋白的自我组装。所述亚基在合适的宿主中得以表达，然后自组装成某种颗粒，其在结构上类似真正的病毒，但因缺少病毒基因组而没有感染性。这些所谓的病毒样颗粒(VLPs)大体来说是高度免疫原性的，因为组成它们的结构蛋白在每个单独的颗粒中有多个拷贝。这种高密度抗原呈递使得这些颗粒能够特别有效地激发强抗体反应。HBV和HPV疫苗是基于由相应病毒自身的结构蛋白组装而成的VLPs JSVLPs也可以作为支架用于异源表位的高密度展示。由于VLPs—般代表了高度重复，因此也是高度免疫原性的结构，它们可以来源于任何数量的不同病毒类型。专利技术所述方法致力于利用RNA噬菌体(尤其是MS2和PP7)VLPs，通过与噬菌体展示类似的方法进行免疫原展示和表位搜寻。RNA噬菌体。单链RNA噬菌体是一组在自然界中广泛分布的病毒。有多种RNA噬菌体在基因组序列、分子生物学和衣壳结构与组装方面已被深入研究过。MS2可能是这组病毒中被最好地研究过的成员，也是专利技术人实验室中进行过的多数工作的重点，虽然我们的近期工作也探索了称为PP7的相关噬菌体。MS2含有3569个核苷酸组成的单链RNA基因组，其仅编码四种蛋白成熟酶、外壳、裂解和复制酶。病毒颗粒由180个外壳多肽、一个成熟酶分子和一个拷贝的RNA基因组构成。因为外壳蛋白自己完全负责二十面体壳的形成，可以由质粒以单个基因的产物生成MS2VLP。因此，与用于肽展示的其他噬菌体相比，RNAVLPs出奇地简单。专利技术人近期报道 了对MS2和PP7VLPS进行改造用于肽展示和亲和 选择，本文件后面也将有描述。通过常规噬菌体展示进行的表位鉴定。噬菌体展示是可能呈递大的随机氨基酸序列文库的几种技术中的一种，其目的在于从中挑选具有某些特定功能(例如，结合特定抗体的能力)的肽。最常用的噬菌体展示方法建立在丝状噬菌体(例如M 13)的基础上。基本的想法是生成重组噬菌体基因组，所述重组噬菌体基因组含有随机化序列文库，这些随机化序列在噬菌体的DNA基因组中与病毒结构蛋白之一进行了基因融合。这些重组体被转染到细菌中时，每个生产出的病毒颗粒在其表面展示特定的肽并包装着编码所述肽的相同重组基因组。这就建立了对所述方法很重要的基因型和表现型的联系。通过利用亲和选择，然后将选中的经过在大肠杆菌中生长进行扩增，可以从复杂的肽展示噬菌体文库中挑选任意功能(例如能够结合受体，免疫原性)。在非常大的肽展示噬菌体文库中，很小的一部分能够结合特定受体(例如单克隆抗体)，可以通过亲和纯化，然后在大肠杆菌中增殖而对它们进行扩增。通常反复进行几轮选择和扩增即可得到较为简单的群体，从中将展示具有所需活性的肽的单个噬菌体克隆，然后进行表征。当选择分子是抗体时，这样鉴定到的肽代表该抗体能够识别的表位，并且在合适的条件下，可能能够在接受免疫的患者或动物中激发象该表位在其天然抗原中激发的特异抗体反应。但是丝状噬菌体展示存在缺陷。最重要的是，丝状噬菌体分子生物学的某些怪异之处使得它很难或者不可能以足够引起真正强的免疫原性的高密度对肽进行展示。这意味着虽然可以通过亲和选择鉴定到肽表位，但要把它们作为免疫原(即疫苗)，还是必须化学合成，然后偶联上免疫原性更强的载体。不幸的是，肽在亲和选择和优化过程中，当脱离它所处的结构环境时经常失去活性。相反，本文描述的RNA噬菌体VLP展示系统建立了在单一平台上进行亲和选择以及免疫原性表位呈递的能力。这是高密度肽表位展示和亲和选择性能结合在一起的结果，意味着在免疫过程中可以维持表位在亲和选择时的结构制约，从而提高了表位保留激发预期抗体反应所需的结构的可能性。RNA噬菌体VLP展示方法的概沭。专利技术人先前描述过基于RNA噬菌体(包括MS2和PP7)VLPs的肽展示和亲和选择技术，此处仅作简单解释。VLP展示方法的建立需要满足两个前提条件首先必须鉴定到一种形式的RNA噬菌体外壳蛋白，和它内部的一个位点能够容忍插入外来肽而不破坏它恰当折叠并组装成VLP的能力。外壳蛋白表面上的AB环被选中作为肽插入位点。插入这里的肽突出展示在VLP表面。不幸的是，野生型外壳蛋白对于在AB环插入肽极其不容忍，绝大多数(通常>98%)最终不能折叠。外壳蛋白正常情况下折叠成二聚体，90个二聚体组装成二十面体VLP。专利技术人设计制成了新型外壳蛋白使它更稳定，并且更容忍AB环插入。为了这个目的，专利技术人利用了二聚体中两个相同多肽链N和C末端的接近性(图I)。通过复制外壳蛋白编码序列，然后将两个拷贝融合成单个读框，专利技术人制作了所谓单链二聚体。蛋白的这种形式在热动力学上显著更稳定，其折叠对插入到单链二聚体中下游拷贝的AB环中的肽明显更容忍。得到的VLPs每个二聚体展示一个肽，或者每个VLP展示90个肽。肽展示/亲和选择性能的第二个前提条件是表现型与基因型的关联性，因为给亲和选择到的序列提供一个扩增手段很重要。该项要求的满足是专利技术人证实RNA噬菌体VLPs包裹着引导其合成的信使RNA。这意味着亲和选择到的肽-VLPs可以通过逆转录和聚合酶链式反应来扩增。当选择目标是单克隆抗体时，得到 的亲和选中的VLPs代表了用于在动物或患者中激发抗体的疫苗候选物，所述激发的抗体的活性模拟挑选使用的抗体的活性。与肽展示效价及其控制相关的考虑。本申请描述了这样的质粒载体，所述质粒载体能够帮助构建位于RNA噬菌体VLPs上的复杂随机序列和抗原片段文库，以及从所述文库中亲和选择与特异单克隆抗体(或其他任意受体)结合的肽。注意正如前面描述本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DS皮博迪，B查克里安，
申请(专利权)人：STCUNM公司，
类型：
国别省市：
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