创新纳米孔测序技术制造技术

用于长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。总体来说，本公开描述新颖测序技术，其基于并入纳米通道以使用宽间隔(>波长)、～1‑nm孔径“曲折”纳米孔来递送单一长链分子，所述纳米孔充分地减缓易位以便使用光学技术来提供大规模并行、单一碱基解析。使用简单胶状纳米颗粒的新颖、定向自组装纳米制造方案用于在纳米通道顶上形成纳米孔阵列，从而使长链分子展开。在纳米颗粒阵列的表面，工程化等离子/极化声子结构中的强烈局部电磁场允许使用光学技术来进行单一碱基解析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景人基因组是二倍体，并且除非所有多态性或变体得以定型并指派至具体染色体，否则基因组序列是不完整的。另外，整个染色体景观必须加以解码，包括基因组中的复杂结构变体(即，非整倍性、易位、倒置、重复、损失杂合性等)。举例来说，平衡易位发生于500个个体中的约1个个体，三体性21发生于650个活产中的多达1个活产，并且广泛基因组不稳定性发生于许多癌症中30-32。因此，完全基因组测序必须能够识别所有复杂基因组变体。许多超高通量测序技术可利用(例如，Illumina/Solex1、SOLiD2,3、Roche/4544、PacBio5-9、Ion Torrent10-12等9)和在研发中[例如，ZS Genetics9、IBM13GE(美国专利号7264934)、Oxford Nanopore14、Noblegen15、Bionanomatrix16和GnuBIO9。虽然测序成本已经极大地降低，但是此技术仍然不能完全将人基因组测序。在由249个支架组成的GRCh37版本的基因组中，仍然有未测序的人基因组的许多区域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/data.shtml)17-19。另外，所有当前商用技术需要参考基因组以便高质量组装。虽然使用短阅读技术，重新基因组组装是可能的，但是相对于重测序工程来说，质量较低。20这些问题限制下一代测序平台识别某些变体，诸如较大结构变化和重复区域的能力。高通量、长阅读测序技术对于解析人基因组的复杂性是必不可少的。人基因组是二倍体，意味着存在各自22个常染色体的两个拷贝和性别染色体的两个拷贝(XX或XY)。长阅读对于定型每个同源染色体独有的遗传变体来说是必需的。另外，基因组中的重复区域使得通过短阅读来测序是不可能的。下一代测序技术的最近进展，与稳健分析方法的研发，给予研究人员确定序列变化在各种人疾病中的作用的能力。然而，绝大多数这些方法产生的结果限于发现多态性，而忽视单倍体型的重要性。现在最常研究的变化是单核苷酸多态性(SNP)以及小插入和缺失(InDel)。这是因为虽然当前世代测序方法精通于识别杂合基因座，但是不能将多态性指派至两个同源染色体中的一个，由此使基因/疾病关联的研究复杂化。HapMap和其它工程正在开发单倍体型图谱21-23，但是需要新的方法来解决变体中的发生于罕见基因型(例如，新颖体细胞突变)或变化基因组(例如，癌症)中的顺式和反式关系。缺乏从当前测序方法获得的单倍体型信息限制科学家得出重要生物和医学结论的能力，也就是说，因为多态性列表分类为纯合或杂合，所以其忽视每个多态性情况的重要性。因此，研究人员经常只关注于出现在蛋白质编码区域(外显子组)中的变体，因为仅其重要性可预测。在不知道是否基因间区域的变体在顺式中和/或经由远距离染色质相互作用与患病基因有联系的情况下，不可能预测这些变体是否有害。单倍体型解析测序优于标准全基因组测序(WGS)的主要优势是将所有多态性指派至具体染色体(例如，母系相比于父系)，并且在远端调控元件中的突变(或变体)与同一染色体上的顺式连接基因之间建立联系。与直接单倍体型测序相关联的限制主要围绕相对短阅读长度和当前平台的‘定型不灵敏性’。24-26存在产生单倍体型解析序列的少许方法，但是这些方法不符合$1,000基因组目标，这是由于与测序上游过程相关联的复杂性和额外成本。27-29纳米孔DNA测序技术是有吸引力的，因为其提供DNA序列信息的直接访问，而不需要序列信息的扩增或复杂后处理，并且有希望高速执行长阅读。33,34存在研究与开发各种纳米孔技术的较长历史。然而，上述希望仍未完全实现，并且事实上，除了特别构建的测试DNA样品的阅读以外，还未报告任何阅读。(与Jeremy一起检查此叙述)另外，未报道使用纳米孔技术来进行单一碱基解析。在以前研究中确定的问题包括：1.～1碱基/μs的转导速度(需要较高带宽电学检测，伴随有噪声和统计波动问题)。2.大于单一碱基的纵向解析度(对于生物孔，通常～4个碱基)35。3.使用电读出机制很难进行大规模并行应用。已经研究生物和固态纳米孔技术。对于生物系统，α-溶血素36和遗传工程化MspA37是最常见纳米孔，并且已经展示减缓DNA易位的各种技术，涉及使用酶38或与dsDNA区域一起拾取的ssDNA链的修饰或减缓易位的其它干扰39。然而，与纳米孔内的碱基的较大数目相关联的难题仍然存在。35对于固态孔，最常见材料是氮化硅和蓝宝石，其使用离子或电子射束技术来形成纳米级孔。石墨烯是另一种吸引很多关注的材料40,41。原子层沉积可在刻蚀后用于细化孔尺寸。42也有人研究了固态孔添加生物结构的混合技术。43尽管所有此类活动，纳米孔技术的希望仍未实现。所有这些方法的一个最终难题是需要调整至大规模并行应用，以便成本有效制造。目前制造方法由直接写入技术(电子射束和离子射束刻蚀)主导，这些技术不可调整至大规模并行架构，也与低成本地广泛采用此技术不相容。电学测量不容易调整至在离子流体环境中进行并行测量，光学测量提供并行处理的最有希望的途径，此议题提供必需单一碱基解析。专利技术概要本公开提供用于长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。总体来说，本公开描述新颖测序技术，其基于并入纳米通道以使用宽间隔(>波长)、～1-nm孔径“曲折”纳米孔递送单一长链分子，所述纳米孔充分地减缓易位以便使用光学技术来提供大规模并行、单一碱基解析。使用简单胶状纳米颗粒的新颖、定向自组装纳米制造方案用于在纳米通道顶上形成纳米孔阵列，从而展开长链分子。在纳米颗粒阵列的表面，工程化等离子/极化声子结构中的强烈局部电磁场允许使用光学技术来进行单一碱基解析。表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学(SECARS)是具有不需要将碱基标记的优势的一种这类技术。具有标记碱基的荧光技术提供替代可能性。附图简述图1是纳米通道制造的示例性方法的示意图。图2是展示形成具有1μm间距的纳米通道的光致抗蚀剂图案的SEM图像。图3是展示使用本文所述技术所形成的1D封闭通道的SEM图像。图4是通过50-nm直径二氧化硅纳米颗粒形成的500nm宽通道壁的SEM图像。图5是使用本文所述技术形成的100nm宽通道的SEM图像。图6是展示使用本文所述技术形成的多层纳米通道的SEM图像。图7是包括中断纳米通道的多孔屏障的如本文描述结构的示意图。图8是穿过图7的纳米通道的样品流的顶部示意图。图9是穿过图7的纳米通道的样品流的侧视图。图10是使用本文提供方法制造的纳米通道顶盖的高解析度SEM图像。图11是在沉积Si3N4CVD层之后图10的顶盖的高解析度SEM图像(在右侧部分蚀刻以形成储槽)。白色圆圈标识恰好在蚀刻进行时出现的孔。图12是如本文描述纳米通道结构的示意图，其展示越过在纳米通道中形成的屏障，液体渗透穿过顶盖。图13是具有纳米通道和一个3μm屏障的样品的图像。图14是展示在施加电场的情况下沿着三个3-μm宽屏障的流体液滴的图像。图15是本公开的纳米孔结构的示意图，其具有在曲折纳米孔结构的顶盖上组装的至少一个制造纳米孔。图16是其中将曲折纳米孔结构施加至现有纳米孔结构的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于形成供操控目标长链分子的装置的方法，其包括：提供纳米通道，所述纳米通道具有共同多孔顶盖，所述顶盖包括多个曲折纳米孔；并且经由共形原子层沉积(ALD)将所述多孔顶盖中的所述纳米孔中的一些加以密封。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.26 US 61/9091161.一种用于形成供操控目标长链分子的装置的方法，其包括：提供纳米通道，所述纳米通道具有共同多孔顶盖，所述顶盖包括多个曲折纳米孔；并且经由共形原子层沉积(ALD)将所述多孔顶盖中的所述纳米孔中的一些加以密封。2.如权利要求1所述的方法，其还包括经由化学气相沉积(CVD)在所述顶盖上形成一个层。3.如权利要求1所述的方法，其中所述未密封孔中的至少一个的大小使得能够以一次一个的方式将单一长链分子易位。4.如权利要求1所述的方法，其中所述未密封纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析。5.如权利要求1所述的方法，其还包括将场增强结构沉积于所述纳米通道的所述顶盖上。6.如权利要求5所述的方法，其中所述场增强结构与所述纳米孔自动对齐。7.如权利要求5所述的方法，其还包括形成与所述场增强结构间隔开的额外光学透明层。8.如权利要求5所述的方法，其中所述场增强结构是金属绝缘体金属(MIM)结构。9.如权利要求7所述的方法，其中所述MIM结构通过各向异性和各向同性沉积过程的组合来沉积。10.如权利要求8所述的方法，其还包括形成与所述MIM结构间隔开的额外光学透明层。11.如权利要求1所述的方法，其还包括在密封所述纳米孔中的一些之前，提供接触所述多孔顶盖的覆膜。12.如权利要求11所述的方法，其还包括在密封所述纳米孔中的一些之前，在所述覆膜中制造纳米孔。13.如权利要求1所述的方法，其中提供具有多孔顶盖的纳米通道的步骤包括：在衬底上沉积感光膜堆叠；在所述膜堆叠上形成图案；沉积多个纳米颗粒以在所述图案上形成包括具有顶盖的通道的结构；在保持由所述多个二氧化硅纳米颗粒形成的所述结构的同时，移除所述图案；并且保持由所述多个纳米颗粒形成的所述结构。14.一种用于长链分子操控的装置，其包括纳米通道，所述纳米通道具有部分密封多孔顶盖，所述顶盖包括多个曲折纳米孔。15.如权利要求14所述的装置，其还包括整合在所述曲折纳米孔顶上的覆膜。16.如权利要求15所述的装置，其中所述覆膜包括所制造纳米孔。17.如权利要求14所述的装置，其还包括场增强结构。18.如权利要求14所述的装置，其中所述场增强结构与所述未密封曲折纳米孔中的至少一些对齐。19.如权利要求16所述的装置，其中所述场增强结构与所制造纳米孔中的至少一些对齐。20.如权利要求17所述的装置，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属(MIM)结构。21.如权利要求14所述的装置，其还包括与所述多孔顶盖间隔开的光学透明层。22.一种用于操控目标长链分子的方法，其包括：提供纳米通道，所述纳米通道具有部分密封多孔顶盖，所述顶盖包括多个暴露未密封孔和多个曲折纳米孔；将包括所述目标分子的样品引入所述纳米通道中；在所述目标分子行进穿过所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：SRJ布吕克，JS爱德华兹，A诺伊曼，Y库斯内特索瓦，EA门多扎，
申请(专利权)人：STCUNM公司，
类型：发明
国别省市：美国;US