注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(1-84)及其代谢产物rhPTH(1-34)血药浓度的测定方法，属PTH血浆浓度测定技术领域。本发明专利技术用固相萃取结合放射免疫分析(RIA)法，血浆样本采用固相萃取柱StyreScreen?H2P萃取，rhPTH(1-84)用甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH测定：取rhPTH(1-84)标准品或处理后的血浆样品加入ELSATUBES，再加入125I-PTH，复管测试，γ-count测计数CPM；以CPM值为纵座标，rhPTH(1-84)浓度为横坐标作图，得回归方程Y=19.791X；rhPTH(1-34)用甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH1-34)测定；将双复管加样品加抗体；孵育；每管加入125I-PTH后，振荡混匀后孵育；加羊抗兔，正兔血清，孵育；γ-counter测计数B，按B0=TB-NSB，以B/B0为纵坐标，rhPTH(1-34)浓度对数为横坐标作图，得函数方程。本发明专利技术提高了RIA检测的重复性和稳定性，增加了测定数据的可靠性。
【技术实现步骤摘要】
注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(1-84)及其代谢产物rhPTH(l_34)血药浓度的测定方法，属于PTH血浆浓度的测定方法
技术介绍
PTH是甲状旁腺分泌的天然甲状旁腺素，其中具有生理活性的是含84个氨基酸残基的多肽激素，它可以刺激新骨形成和维持正常钙的平衡及磷代谢。注射用重组人甲状旁腺素(1~84) (Recombinant human parathyroid hormone (1-84) for injection，简写为rhPTH(l-84))是一种含PTH全长序的重组人甲状旁腺素，由美国NPS_Allelix公司研发，2006年被FDA批准用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。rhPTH(l-84)在体内可以部分降解为rhPTH(1-34)，rhPTH(1-34)结构与rhPTH (1-84)的N端34个氨基酸序列一致， rhPTH(1-34)可以增加骨密度、增强骨质和改善骨骼架构而成为骨质疏松症的主要治疗手段。rhPTH(l-34)由美国Eli Lilly公司研发，2002年FDA批准上市，在治疗绝经后骨质疏松症和部分老年男性骨质疏松症方面具有良好的疗效。rhPTH(l-84)具有更好的安全性，两者均为重要的抗骨质疏松症治疗药物，但由于每天必须服用使得价格过于昂贵限制了其临床应用。由于社会老龄化，骨质疏松症发病率逐年升高，rhPTH(l-84)因对骨量的增加效应比目前临床应用的其他治疗手段更有效而具有良好的临床应用前景，国内有多家生物制药公司在研发中。rhPTH(1-84)在体内可以降解为不同长度的肽链，由于rhPTH(l_34)具有较高的药效性，因此测定rhPTH(1-84)的代谢产物rhPTH(1_34)在血浆中的浓度及药动力学研究， 对了解注射用rhPTH(l-84)的药效学、作用机制及临床合理用药具有重要意义。PTH血浆浓度的测定方法有放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、高效液相-质谱检测法(HPLC-MQ等。HPLC-MS法需特殊检测器，使用价格昂贵；ELISA及RIA分析法方法简便、操作便利，但由于血浆成分的复杂性，造成测定结果重复性和稳定性差等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(l_84)及其代谢产物 rhPTH(1-34)血药浓度的测定方法，采用固相萃取结合RIA检测同时测定rhPTH(l_84)在血浆中的浓度以及代谢产物rhPTH(1-34)血浆浓度的变化及药动学研究。提高了 RIA检测的重复性和稳定性，增加了测定数据的可靠性。本专利技术的技术方案一种注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(l_84)及其代谢产物 rhPTH(l-34)血药浓度的测定方法血浆样本采用固相萃取柱Myre Screen H2P萃取， rhPTH(1-84)采用甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH测定rhPTH(l_34)采用甲状腺素放免试剂盒 RK-055-08 (PTH 1-34)测定。41、标准溶液制备rhPTH(l-84)标准溶液的制备取rhPTH(l-84)标准品，用去离子水溶解振荡，配制浓度分别为0、对、55、177、 520pg · mL-1标准品溶液；内质控(PC)配制成rhPTH(l_84)浓度为46 pg · mL-1的溶液；外质控OlC)配制含rhPTH(l-84)标准品浓度为25、250、500 pg · mL—1三种标准溶液，分装于离心管中，-80°C保存待用；rhPTH(l-34)标准溶液的制备取 rhPTH(l-34)标准品用缓冲液稀释成 10，20，40，80，160，320，640，1280 pg · mL—1 的标准溶液；QC质控样品精密称取rhPTH(l-34)标准，用缓冲液配制含rhPTH(l_34)浓度分别为 40. 00、160. 00、640· 00 pg · mL_1 ；所述缓冲液为甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH 1-34)所提供的缓冲液；下同。2、血浆样品处理将固相萃取柱Myre Screen H2P用ImL乙醇、ImLO. 1%三氟乙酸去离子水活化；吸取 0. 5mL血浆样本，以广2mL/min的速度加入固相萃取柱，样品富集后用ImL去离子水淋洗，抽干；用乙醇-0. 1%三氟乙酸水(V/V，60:40)溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥 15min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器浓缩干燥，测定时用缓冲液稀释到合适的浓度； 3、操作流程rhPTH(l-84)测定操作流程取200μ rhPTH(l-84)标准品或固相萃取处理后的血浆样品加入ELSA TUBES (固相包被好的ELSA试管，甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH提供)，分别加入ΙΟΟμ 125I-PTH振荡3 分钟，复管测试，25°C孵育18士池，弃上清，加3mL吐温20，5分钟后弃上清，重复洗涤4次， Y-count 测计数(CPM)；rhPTH(l-34)测定操作流程用甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH 1-34)进行操作，将聚苯乙烯管编号总管 (TC)，非特异性结合(NSB)，总结合(TB)，标准A H，阳性对照PC，样品S，双复管加样品加抗体；振荡混勻后，封口 4°C孵育16 Mh;每管加入100 μ L 125I-PTH后，振荡混勻后 40C孵育16 Mh;加羊抗兔IgG(GAR)，正兔血清(NRS)，振荡室温孵育90分钟；除TC管外每管加500 μ L缓冲液振荡混勻，3000rpm离心20分钟(4°C )，吸弃上清(在15 30分钟内完成)，残余物Y -counter测量得~，并计算B=Bx-NSB。4、计算方法 rhPTH(l-84)浓度计算用CPM对rhPTH(l-84)浓度作图，得回归方程y=ax (Y=19. 791X)。从方程中求得血浆样品中rhPTH(l-84)浓度，用DAS 2. 0软件计算药代动力学参数。rhPTH(l-34)浓度计算Y -counter 测得计数按 Btl=TB-NSB, B/B0 (%) = (Bx-NSB) /B0X 100% 计算，以 B/BQ 为纵坐标，rhPTH(l-34)浓度对数为横坐标作图，曲线拟合得函数方程，从方程中求得血浆样品中 rhPTH(l-34)浓度，用DAS 2. 0软件计算药代动力学参数。本专利技术的有益效果本专利技术采用添加抑肽酶、固相萃取等多种途径降低RIA影响因素，考察了不同填料固相小柱的萃取效率，并对方法学进行了考察，提高了测定结果的重复性和稳定性。rhPTH (1-34)的研究较多，但作为rhPTH (1_84)的代谢产物研究其血药浓度和药动学未见报道，本专利技术为rhPTH(l-84)进入临床应用提供精确的临床试验检测方法。附图说明图1 rhPTH(1-84)标准曲线。图2 rhPTH(1-34)标准曲线。图3不同批次rhPTH (1-84)稳定性。图4 rhPTH(1-84)长期贮存稳定性。图5 rhPTH (1-84)和rhPTH (1-34)血药浓度-时间曲线图。具体实施方式实施例1线性范围 rhPTH (1-84)线性范围取浓度为0、24、55、177、520 pg · mL—本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周杏琴，蔡刚明，钦晓峰，邹美芬，徐希杰，张建康，曹国宪，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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