本发明专利技术提供一种治疗骨质疏松重组人甲状旁腺素(1-34)及其制备方法，通过人工合成编码重组人甲状旁腺素(1-34)氨基酸序列的DNA序列，并克隆入表达载体中构建重组质粒，将其转化入宿主细胞，并获得融合表达甲状旁腺素(1-34)的基因工程菌，发酵培养工程菌，经过表达后的处理工作，获得甲状旁腺素(1-34)。本发明专利技术所提供的重组人甲状旁腺素(1-34)与人体内天然的人甲状旁腺素(1-84)的C-端的第1-34个氨基酸具有相同的氨基酸序列，并且二者具有相同的生物活性和生理、药理学特征，且工艺简单，重现性好，适合于工业化大生产。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种治疗骨质疏松重组人甲状旁腺素(1-34)及其制备方法，通过人工合成编码重组人甲状旁腺素(1-34)氨基酸序列的DNA序列，并克隆入表达载体中构建重组质粒，将其转化入宿主细胞，并获得融合表达甲状旁腺素(1-34)的基因工程菌，发酵培养工程菌，经过表达后的处理工作，获得甲状旁腺素(1-34)。本专利技术所提供的重组人甲状旁腺素(1-34)与人体内天然的人甲状旁腺素(1-84)的C-端的第1-34个氨基酸具有相同的氨基酸序列，并且二者具有相同的生物活性和生理、药理学特征，且工艺简单，重现性好，适合于工业化大生产。【专利说明】一种治疗骨质疏松的重组人甲状旁腺激素(1-34)
:本专利技术涉及利用基因工程技术制备多肽或蛋白的方法，尤其涉及一种治疗骨质疏松的重组人甲状旁腺激素(1-34)，属于生物
。技术背景:骨质疏松症为一种以骨量降低和骨的微结构退化为特征的全身性骨骼疾病，其后果为骨的脆性增加和容易发生骨折。它是一些老年性人口增加国家的主要健康问题。目前在全世界大约累及1500万人的健康。其中包括所有绝经期妇女的三分之一。仅在美国，骨质疏松症在美国每年造成150万人发生骨折，40万人需要进行住院治疗，4400万人次-天的家庭护理，花费大约140亿美圆的健康护理费用，现行的治疗骨质疏松症的药物，包括补钙、维生素D、二磷酸盐、降钙素、氯化钠、雌激素及其衍生物等，主要是通过抑制破骨细胞的活性，减缓骨质的分解而减少骨质流失，达到缓解骨质疏松症。甲状旁腺激素(PTH)，是调节骨细胞新陈代谢的重要因子，既可刺激破骨细胞的增殖及其对老化骨质的分解，又具有促进成骨细胞合成新骨的作用。甲状旁腺激素可以激活成骨细胞活性，分解吸收老化骨质，增加骨质量及骨质密度。此外甲状旁腺激素可以促进肾小管细胞对钙离子的再吸收，激活肾脏产生Ia羟化酶，后者使维生素D3Z转化为la，25 (OH) 2维生素D3，从而促进小肠上皮细胞对钙离子的吸收，为成骨细胞合成新骨提供物质保障。因此，甲状旁腺激素可能成为治疗骨质疏松症的理想药物。甲状旁腺激素含84个氨基酸，简称PTH (1-84)，其N-端1_34个氨基酸片段是天然PTH的活性部分。天然甲状旁腺激素由甲状旁腺分泌，当其进入血液内后，很快代谢为N-端1-34氨基酸片段，后者与PTH受体结合发挥生物学活性强于天然甲状旁腺激素。由于hPTH在治疗骨质疏松症方面可能具有很好的应用前景，关于PTH制备方法的研究逐渐引起了人们的重视，除了用固相肽方法合成较短的PTH1-34肽及其类似物外，Forsberg G和BrobjerM等还将Hpthl_34肽基因和IgG结合蛋白融合后,在大肠杆菌中进行表达，利用Thrombin&H64A两种酶切加工手段，分别得到5mg/L和8mg/l的最终得率。Yuji Suzuki, Masayuki Yabuta and Kazubiro Ohsuye 则利用 B-galactosidasederivative与PTH(1-34)融合后在大肠杆菌中形成包涵体，利用Kex2_660和V8蛋白酶对其进行修饰已得到正确加工的hPTH(l-34)肽。然后，通过一下工艺是流程是:菌体发酵-洗涤纯化融合蛋白(包涵体)_酶解-加乙酸初步去除杂质蛋白-POROS HS50柱纯化-P0R0SR250纯化-去除乙腈-TSK凝胶-120T纯化的纯品，最终，得到了 0.5g/l的产量。然而，到目前为止，甲状旁腺激素1-34的生产工艺还不能十分令人满意。因为本领域迫切需要开发新的生产PTH(1-34)肽的工艺。
技术实现思路
:本专利技术的目的在于:针对现有技术，提供一种药物及其制备新方法；本专利技术另一个目的是所提供的药物对骨质疏松，特别是绝经后妇女骨质疏松症的治疗具有显著的疗效；本专利技术所提供的药物作用明显，毒性很低，用药安全、价格低廉，且生产工艺科学合理，操作可行、生产成本低。本专利技术是这样构成的:设计并合成了编码人甲状旁腺素(1-34)的双链DNA序列，并将该片段克隆入表达载体中形成重组质粒，重组质粒转化入菌体，经筛选得到高效表达人甲状旁腺素(1-34)基因工程菌株。该基因工程菌以Thioredoxin为融合伴侣融合表达hPTH(l_34)，所表达的融合蛋白经过分离纯化后，得到高度纯化的rhPTH(l-34)。更为具体的制备工艺为:甲状旁腺素(1-34)是由甲状旁腺合成和分泌的甲状旁腺激素的活性片段，按照遗传密码的通用性、简并性和大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则，设计并合成了适合在大肠杆菌表达的编码人甲状旁腺素(1-34)的双链DNA序列片段；片段克隆入表达载体pTDa中形成重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌HB101，经筛选得到高效表达人甲状旁腺素(1-34)基因工程菌株HXBOl ；基因工程菌以Thioredoxin为融合伴侣融合表达hPTH(l_34)，所表达的融合蛋白经过分离纯化；采用凝血酶(Thrombin)将hPTH(l_34)从融合蛋白上切割下来,经过分离纯化,得到高度纯化的rhPTH(1-34)。`具体的实施方式为:说明:以下说列举的实施例只为更充分的说明本专利技术，但并不限制本专利技术所要求保护的内容。实施例1:基因工程菌的构建及稳定性考察1、基因的设计与表达载体选择按照现有技术合成PTH (1-34)，并选择pTDa作为表达载体，该载体具有如下特点:①具有强启动子Ptac，其转录启动能力比LacUV5启动子强5倍，从而为rhPTH(l-34)融合蛋白的高效表达提供了前提条件；②Thioredoxin(硫氧还蛋白)编码序列，来源于E.coli K12菌株,在表达载体中作为融合伴侣，hPTH(l-34)基因与其C-末端同相位融合。Thioredoxin作为融合伴侣，本身的分子量不大(约为12KDa)，因而间接提高了目的多肽在整个表达中所占的比例；更为重要是Thioredoxin具有质子供体的功能,在因融合蛋白高效表达而形成包涵体的情况下，在包涵体的复性过程中，Thioredoxin能催化融合蛋白复性,从而极大提高复性效率，使工艺得到简化。③多克隆位点(MCS)位于Thioredoxin基因的C-末端，利于目的基因在Thioredoxin基因C-末端融合表达。3.重组质粒的构建①目的基因片段的制备:大量制备含hPTH(l_34)基因片段的pUC18载体，用EcoRI和SalI双酶切下hPTH(l_34)编码基因小片段，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化hPTH(l-34)编码基因片段。②表达载体大片段的制备:大量制备pTDa质粒DNA载体，用EcoRI和SalI双酶切质粒，用低熔点琼脂糖法分离、回收PTDa的质粒DNA大片段，并用酚氯仿对所提取DNA进行纯化。用小牛碱性磷酸酶对分离纯化好的PTDa的质粒DNA大片段进行脱5’-磷酸化处理。③重组质粒DNA的构建及转化:将纯化好的目的基因片段和表达载体大片段按5: I比例混合，加入适量的T4 DNA Ligase、相应的反应缓冲液和终浓度为ImM的ATP，16°C保温4小时。将重组质粒转化大肠杆菌HBlOl，经筛选即得rhPTH(1-34)高效表达基因工程菌 HXBOI。实施例2:rhPTH(l-34)融本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗骨质疏松重组人甲状旁腺素(1?34)，它包括下述步骤获得：①设计并人工合成编码甲状旁腺素PTH1?34氨基酸序列的DNA序列；②构建含有甲状旁腺素PTH1?34多肽编码序列的重组质粒的表达载体；③将重组质粒转化入宿主细胞，获得融合表达或者非融合表达的甲状旁腺素PTH1?34基因工程菌；④发酵培养工程菌；⑤表达后处理，获得甲状旁腺素PTH1?34。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董佳里，钟邵东，徐小萍，
申请(专利权)人：成都博发生物技术有限公司，天津博发生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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