一种制备重组人源血管内皮生长因子VEGF165的方法技术

本发明专利技术涉及制备重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的方法，包括步骤①构建用于表达不带标签的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的表达载体，②通过表达系统表达重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165，③分离和用阴离子交换柱纯化重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165。本发明专利技术还涉及用于上述方法制备的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的复性方法和纯化方法。本发明专利技术所获得的rh-VEGF165不含任何纯化标签同时也避免了使用肠激酶切除6×His-Tag及后续从rh-VEGF165中纯化去除6×His-Tag标签和肠激酶的步骤，大大简化了rh-VEGF165的纯化工艺，降低了生产成本，极大地方便了rh-VEGF165的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种制备重组人源血管内皮生长因子VEGF165的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及重组人源血管内皮生长因子VEGF165蛋白的制备方法。
技术介绍
血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)又称血管通透因子(Vascularpermeabilityfactor，VPF)，是一种特异性作用于内皮细胞的多功能因子，作为特异的内皮细胞有丝分裂素，它是最主要的血管生成因子。它不仅与胚胎发育、创伤修复、骨形成改建等生理性过程有关，而且参与心血管疾病、缺血缺氧性疾病等病理性血管形成过程，尤其与肿瘤新生血管的形成、生长、浸润、转移等密切相关。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。由于mRNA不同的剪切方式，产生了VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进其增殖，增加血管的通透性。VEGF165是人类组织中VEGF主要的基因产物，也是VEGF家族中最重要的血管生成调节因子。随着VEGF在癌症药物研发中变得越来越重要，市场上对有生物活性的VEGF的需求也越来越大。由于VEGF在人体血液中含量不高，来源非常有限，导致其提取难度大、产量甚微，远远不能满足需要，因此，利用基因重组技术大量生产有生物活性的VEGF势在必行。利用基因工程技术、以微生物为载体生产外源蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已经发展了多种蛋白表达系统。大肠杆菌表达系统是研究的最清楚的一套原核表达系统，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产等优点，其应用非常广泛。但是常规的用大肠杆菌表达VEGF的系统中，rh-VEGF165通常含有标签，标签的加入影响了rh-VEGF165的生物活性，而且由于需要用肠激酶切除标签的步骤，使蛋白的提纯步骤更加复杂，从而增加了生产成本。
技术实现思路
为解决上述问题，本申请构建了不含有标签的rh-VEGF165表达系统，避免了纯化标签对rh-VEGF165生物活性的影响，本专利技术所获得的rh-VEGF165蛋白生物活性为1.76ng/ml，同sigma公司最优级VEGF165的生物活性相当，说明本专利技术获得的rh-VEGF165具有同天然VEGF165基本一致的蛋白构象。此外，本专利技术制备的rh-VEGF165用阴离子交换柱纯化的效果明显优于CM柱和镍柱的纯化效果，并且简化了步骤，节省了成本。本专利技术提供了一种制备并纯化重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的方法，该方法包括步骤①构建用于表达不带标签的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的表达载体；②利用所述表达载体通过表达系统表达重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165；和③分离并用阴离子交换柱纯化所述表达系统中表达的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165。上述技术方案构建了不含有标签的rh-VEGF165表达系统，避免了纯化标签对rh-VEGF165生物活性的影响，同时用阴离子交换柱纯化简化了纯化的步骤，节省了成本。在一些实施方式中，所述表达系统包括大肠杆菌。在一些实施方式中，所述方法进一步包括复性步骤，所述复性步骤包括利用包涵体复性液复性重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的包涵体。在一些实施方式中，所述包涵体复性液包含浓度大于等于2mM的GSSG和浓度大于等于1mM的DTT，并且DTT与GSSG的摩尔浓度的比例小于1。在一些实施方式中，所述包涵体复性液包含2mM至10mM的GSSG和1mM至5mMDTT，并且DTT与GSSG的摩尔浓度的比例优选地大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5。优选地，所述包涵体复性液包含2mM的GSSG和1mMDTT。在一些实施方式中，步骤①中表达载体选择pET-28a(其图谱见图1)，并且克隆rh-VEGF165基因的插入位点为NcoI和XhoI酶切位点。在一些实施方式中，克隆rh-VEGF165基因的上游引物和下游引物分别为TACATGCCATGGCACCCATGGCAGAAGGAG(下划线为NcoI酶切位点)和ATACCGCTCGAGTTATCACCGCCTCGGCTTGTC(下划线为XhoI酶切位点)。在一些实施方式中，步骤③中所述阴离子交换柱包括强阴离子交换柱和弱阴离子交换柱等。优选地，所述阴离子交换柱为弱阴离子交换柱。更优选地，所述阴离子交换柱为DEAE柱，并且进行DEAE柱纯化之前仅进行一次透析。本专利技术还提供了一种重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的复性方法，所述重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165不带任何表达标签，所述复性方法包括利用包涵体复性液复性重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的包涵体，其中，所述包涵体复性液包括浓度大于等于2mM的GSSG和浓度大于等于1mM的DTT，并且DTT与GSSG的摩尔浓度的比例小于1，优选地大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5。本专利技术还提供了一种重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的纯化方法，所述重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165不带任何标签，所述方法包括用阴离子交换柱纯化重组人源血管内皮生长因子蛋白质。优选地，所述阴离子交换柱为DEAE柱，并且进行DEAE柱纯化之前仅进行一次透析。本专利技术所获得的rh-VEGF165不含任何纯化标签，同时也避免了使用肠激酶切除6×His-Tag及后续从rh-VEGF165中纯化去除6×His-Tag标签和肠激酶的步骤，同时用阴离子交换柱的纯化大大简化了rh-VEGF165的纯化工艺，降低了生产成本，极大地方便了rh-VEGF165的工业化生产。附图说明图1为pET-28a的图谱；图2为pET-28a-hVEGF165重组质粒的酶切检测；图3为BL21(DE3)/pET-28a-hVEGF165诱导表达检测；图4为rh-VEGF165蛋白表达位置检测(20℃诱导)；图5为rh-VEGF165蛋白表达位置检测(37℃诱导)；图6为rh-VEGF165蛋白包涵体的尿素溶解检测；图7为复性体系中DTT与GSSG比率的优化；图8为复性体系中DTT和GSSG浓度的优化；图9为rh-VEGF165包涵体复性液的DEAE柱纯化；图10为rh-VEGF165包涵体复性液的CM柱纯化；图11为hVEGF165/His基因PCR产物的检测；图12为pET-28ar-hVEGF165/His重组质粒的酶切检测；图13为BL21(DE3)/pET-28ar-hVEGF165/His诱导表达检测；图14为rh-VEGF165/His包涵体复性液的镍柱纯化；图15为不同浓度rh-VEGF165刺激HUVEC细胞增殖的作用；图16为rh-VEGF165生物活性(EC50)计算图；图17为不同浓度rh-VEGF165/His刺激HUVEC细胞增殖的作用。具体实施方式本申请中所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。各种试剂和培养基的成分和配置方法可以参见常规实验手册中的描述。为了更好地理解本专利技术的本质，下面结合附图，通过对专利技术较佳实施方式的描述，详细说明制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组人源血管内皮生长因子rh?VEGF165蛋白质的方法，该方法包括步骤：①构建用于表达不带标签的重组人源血管内皮生长因子rh?VEGF165的表达载体；②利用所述表达载体通过表达系统表达重组人源血管内皮生长因子rh?VEGF165；和③分离并用阴离子交换柱纯化所述表达系统中表达的重组人源血管内皮生长因子rh?VEGF165。

【技术特征摘要】
1.一种制备重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的方法，该方法包括步骤：①构建用于表达不带标签的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165的表达载体；②利用所述表达载体通过表达系统表达重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165；和③分离并用阴离子交换柱纯化所述表达系统中表达的重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165，其中，所述阴离子交换柱为DEAE柱，其中在分离纯化步骤之前进一步包括复性步骤，其中所述复性步骤包括利用包涵体复性液来复性重组人源血管内皮生长因子rh-VEGF165蛋白质的包涵体，其中，所述包涵体复性液中包含浓度在2mM至10mM范围内的GSSG和浓度在1mM至5mM范围内的DTT，并且DTT与GSSG的摩尔浓度的比例大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5，且其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱永常，
申请(专利权)人：杭州纽龙日尚生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：