一种水稻开花素重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括RNA提取、重组载体制备、基因工程菌获得、重组蛋白分离纯化等步骤；实验证明，在本发明专利技术低温条件16～20℃下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。本发明专利技术首次尝试了对植物开花素蛋白OsHd3a的原核表达，成功克隆了OsHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过Ni-NTAResin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，所述方法包括RNA提取、重组载体制备、基因工程菌获得、重组蛋白分离纯化等步骤；实验证明，在本专利技术低温条件16～20℃下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。本专利技术首次尝试了对植物开花素蛋白OsHd3a的原核表达，成功克隆了OsHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过Ni-NTAResin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。【专利说明】(-)
本专利技术涉及。(二)
技术介绍
开花是绿色植物特有的现象，开花植物使得世界绚丽多彩。多年来，科学家一直在对植物开花机理进行不懈的探索，并希望对植物开花的周期进行调控。1937年，俄国植物生理学家Mikhail Chailakhyan提出开花素(Florigen)假说,认为植物叶片接收到光信号后会产生某种物质并传递到植物茎顶端诱导花芽产生。利用嫁接等研究方法也进一步发现植物叶子可以通过感受日昼长短变化来感受季节变化，并因此而产生某种物质，引发一种从叶到茎尖的长距离信号传导，最终促进开花。这种可能的物质被称为开花素，但是几十年来开花素的化学本质一直没有被鉴定。最近几年在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oriza sativa)中同时发现了开花素，它是一种可移动的蛋白分子，参与花器官形成的诱导。在拟南芥中开花素是由叶片中Flowering Locus T(FT)基因编码的FT蛋白，可通过维管系统运送至茎尖，激活其它开花相关基因并引起开花。水稻中的FT同源蛋白是0sHd3a，能从叶中传递到莖尖分生组织从而导致水稻开花。在番爺(Solanum Iycopersicum)中也存在 FT 同源基因 SINGLE-FLOWER TRUSS (SFT)，在烟草(Nicotiana tabacum)或番茄中过量表达FT或SFT基因都会促进提前开花。开花素相关的研究结果给我们利用开花的分子机制对植物开花进行调控提供了重要启示，开花素既然是叶片中产生并可以移动的蛋白，那么就可以通过人工的方法生产开花素蛋白并施用于植物，如果可以应用于农作物、花卉观赏园艺等植物进行开花周期的调控，那么具有巨大的应用前景和商业价值。植物的开花年限，既是科学家研究的热点也是实践生产中需要解决的问题。 (三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供。本专利技术采用的技术方案是:，所述方法包括:(I)取开花期水稻叶片，用液氮研磨后，按常规方法提取总RNA ；(2)以水稻总RNA为模板，用扩增弓I物进行RT-PCR，PCR产物经电泳后凝胶回收，回收产物克隆至PMD18-T，获得重组载体pMD18-T-0sHd3a ；所述扩增引物序列如下:h游引物:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’ ；下游引物:5’-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，；扩增得到的核苷酸序列如下:ATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAGGGACCCTCTTGTGGTT GGTAGGGTTGTGGGTGATGTGCTGGACGCGTTCGTCCGGA GCACCAACCTCAAGGTCACCTATGGCTCCAAGACCGTGTC CAATGGCTGCGAGCTCAAGCCGTCCATGGTCACCCACCAG CCTAGGGTCGAGGTCGGCGGCAATGACATGAGGACATTCT ACACCCTTGTGATGGTAGACCCAGATGCACCAAGCCCAAG TGACCCTAACCTTAGGGAGTATCTACATTGGTTGGTCACTG ATATTCCTGGTACTACTGCAGCGTCATTTGGGCAAGAGGTG ATGTGCTACGAGAGCCCAAGGCCAACCATGGGGATCCACC GGCTGGTGTTCGTGCTGTTCCAGCAGCTGGGGCGTCAGAC AGTGTACGCGCCCGGGTGGCGTCAGAACTTCAACACCAA GGACTTCGCCGAGCTCTACAACCTCGGCTCGCCGGTCGCC GCCGTCTACTTCAACTGCCAGCGCGAGGCAGGCTCCGGCG GCAGGAGGGTCTACCCCTAG ；其编码的氨基酸序列如下:MAGSGRDRDPLVVGRVVGDVLDAFVRSTNLKVTYGSKTVS NGCELKPSMVTHQPRVEVGGNDMRTFYTLVMVDPDAPSPS DPNLREYLHWLVTDIPGTTAASFGQEVMCYESPRPTMGIHRL VFVLFQQLGRQTVYAPGffRQNFNTKDFAELYNLGSPVAAVY FNCQREAGSGGRRVYP ；(3)测序正确的重组载体1?18-1'-08!1(13&经限制性内切酶恥61/10 I酶切后，将含目的基因片段插入pET28b，构建重组表达载体PET28b-0sHd3a，经过测序验证后转入大肠杆菌菌株BL21 (DE3)；(4)含重组质粒的表达菌株BL21 (DE3)在37°C活化培养后，挑取单菌落转入LB液体培养基中37°C振荡培养12h，所得菌液按照1:100体积比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液体培养基中，37°C、200r/min培养至OD6tltl为0.4，加入终浓度0.50mmol/L的IPTG，20°C诱导培养至OD6c?为1.0 ;实验证明，在本专利技术的温度条件(20°C)下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。(5)步骤(4)所得菌液经分离纯化，得到所述水稻开花素重组蛋白。优选的，为增加可溶性蛋白的含量，步骤(4)诱导培养时培养基中还可添加有2g/L的葡萄糖。本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术首次尝试了对植物开花素蛋白0sHd3a的原核表达，成功克隆了 0sHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过N1-NTA Resin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。(四)【专利附图】【附图说明】 图1为重组质粒pET-28b_0sHd3a的酶切结果分析；M:marker ; 1:重组质粒pET-28b_0sHd3a ；图2为亲和层析后目的蛋白SDS-PAGE图；图3为IPTG诱导浓度的优化；IPTG浓度为:1:不加IPTG的对照；2:0.25mmol/L ；3:0.SOmmoI /I, ；4: 1.00mmol/L。(五)【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1:一、获得0sHd3a基因的编码区DAN片段；水稻总RNA提取采用RNAiso Reagent试剂盒(Takara公司)进行:取开花期水稻叶片lOOmg，用液氮研磨后，加入提取液按照说明书提取总RNA。提取的总RNA加入DNase去除基因组DNA，进行氯仿抽提纯化后溶于RNase free ddH20，随后参照PrimeScript RT-PCRKit使用说明合成cDNA —链。水稻开花调控基因0s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括：（1）取开花期水稻叶片，用液氮研磨后，提取总RNA；（2）以水稻总RNA为模板，用扩增引物进行RT?PCR，PCR产物经电泳后凝胶回收，回收产物克隆至pMD18?T，获得重组载体pMD18?T?OsHd3a；所述扩增引物序列如下：上游引物：5“?CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG?3“；下游引物：5“?GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG?3“；（3）测序正确的重组载体pMD18?T?OsHd3a经限制性内切酶NdeI/XhoI酶切后，将含目的基因片段插入pET28b，构建重组表达载体pET28b?OsHd3a，经过测序验证后转入大肠杆菌菌株BL21（DE3）；（4）含重组质粒的表达菌株BL21（DE3）在37℃活化培养后，挑取单菌落转入LB液体培养基中37℃振荡培养12h，所得菌液按照1:100体积比加入到含卡那霉素50μg/m?L的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.4，加入终浓度0.50mmol/L的IPTG，20℃诱导培养至OD600为1.0；（5）步骤（4）所得菌液经分离纯化，得到所述水稻开花素重组蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱廷恒，王渭霞，严宏波，汪琨，崔志峰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：