本发明专利技术提供了含重组人甲状旁腺激素的融合蛋白Ｔｒｘ－ＰＴＨ（１－３４）（简称为“Ｔｒｘ－ＰＴＨ１－３４融合蛋白”），编码该融合蛋白的ＤＮＡ序列，含该ＤＮＡ序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白进而生产ＰＴＨ１－３４的方法。用肠激酶对该融合蛋白酶切，可产生具有高度生理活性的重组人甲状旁腺激素ＰＴＨ（１－３４）。本发明专利技术的表达产量高、纯化工艺简单、成本降低，可用于重组人甲状旁腺激素ＰＴＨ（１－３４）的大规模、工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用基因工程方法制备含人甲状旁腺激素PTH1-34的融合蛋白(简称为“Trx-PTH1-34融合蛋白”)进而生产PTH1-34的方法。本专利技术还公开了编码该融合蛋白的DNA序列、含有该序列的重组表达载体和大肠杆菌重组表达菌株以及该融合蛋白的制备方法和用途。
技术介绍
人甲状旁腺激素(PTH)是由人甲状旁腺的主细胞合成并分泌的单链多肽链激素，最初合成的是含115个氨基酸的前甲状旁腺激素原，在粗面内质网去掉N端25个氨基酸残基后形成甲状旁腺激素原。甲状旁腺素原在高尔基复合体内从N端去掉一个六肽，形成84个氨基酸的甲状旁腺激素，分子量9500。PTH与甲状腺C细胞分泌的降钙素、1，25-二羟VD3共同调控血浆中的钙磷水平。PTH是肾脏和骨骼中钙、磷代谢的主要调节剂。其生理作用包括骨代谢的调控、肾小管对钙、磷的重吸收以及肠钙的吸收。人PTH的cDNA序列最早是由Hendy GN等于1981年确定的。1983年，确定了PTH的基因序列。传统的生理学认为PTH对骨是分解代谢作用，但早在1929年就认为甲状旁腺的肽抽提物可以对骨骼产生合成代谢的作用，在动物体内产生骨组织的增加。到目前为止的研究认为，成骨细胞和破骨细胞上均表达PTH的功能性受体，因此，PTH对骨可能有双重调节作用，PTH对破骨细胞有直接抑制作用，并具有由成骨细胞介导的间接调节作用。研究发现，PTH的给药方式会影响它对骨形成的效应，以PTH连续刺激，会抑制骨形成；而将PTH间歇性刺激，则会刺激骨形成。PTH所有已知的细胞外生物学活性都位于这84个氨基酸的蛋白质的N末端，PTH1-34具有完整的PTH生物学活性。因此，PTH1-34可以诱导骨质生成而有效治疗骨质疏松症。PTH1-34在体内很不稳定，含量很低，从天然组织中分离提取几乎不可能。为使hPTH1-34在临床上得到广泛应用，必须找到一种可靠的可以获得大量产品的方法。化学合成的成本和风险性太高，不适合大量生产PTH1-34。随着基因工程重组技术的发展，人们可利用该技术来生产重组甲状旁腺激素。然而，目前已有的生产工艺在表达量纯度和生理活性上难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发表达量高、纯度高、工艺简单且成本低廉的大规模生产具有完全天然甲状旁腺激素生理活性的PTH1-34的生产工艺。
技术实现思路
本专利技术的一个目的就是提供一种用于生产甲状旁腺激素PTH1-34的中间体，它是含有载体pET32b自身编码的融合蛋白序列和人甲状旁腺激素PTH1-34的蛋白序列的融合蛋白。本专利技术的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产PTH1-34的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件(a)硫氧还蛋白元件，该元件具有硫氧还蛋白或其活性片段的氨基酸序列；(b)甲状旁腺素PTH1-34元件，该元件具有人甲状旁腺素PTH1-34或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于硫氧还蛋白元件和甲状旁腺素PTH1-34元件之间的连接肽序列，所述的连接肽含有6组氨酸标签序列和肠激酶酶切位点序列。在另一优选例中，所述的融合蛋白由元件(a)、(b)和(c)构成。在另一优选例中，所述的硫氧还蛋白元件具有SEQ ID NO2中第1-109位的氨基酸序列；所述的甲状旁腺素PTH1-34元件具有SEQ ID NO4中第1-34位的氨基酸序列；或者，所述的接头肽序列具有SEQ ID NO2中第110-158位的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的融合蛋白含有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，它含有上述编码本专利技术融合蛋白的DNA分子。更佳地，所述的载体是表达载体pET32-Trx-PTH1-34。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本专利技术上述的载体。较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。更佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌重组菌株B21(DE3)/Trx-PTH1-34。在本专利技术的第五方面，提供了一种产生本专利技术上述的融合蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤将分离的融合蛋白用肠激酶酶切，然后分离切下的甲状旁腺素PTH1-34。在本专利技术的第六方面，提供了本专利技术上述融合蛋白的用途，它被用作制备甲状旁腺素PTH1-34的中间体。附图说明图1是本专利技术制备方法的流程示意图。图2显示了PTH1-34的cDNA序列(SEQ ID NO3)。图3显示了PTH1-34的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。图4显示了Trx-rhPTH1-34融合基因序列(SEQ ID NO1)及推导的融合蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图中硫氧还蛋白元件SEQ ID NO2中为1-109位，甲状旁腺素PTH1-34元件为159-192位，连接肽为110-158位，包括6His(117-122位)、凝血酶(thrombin)酶切位点(126-131位)、S·Tag(134-148位)、肠激酶酶切位点(154-158位)。图5是表达载体的电泳图。其中各泳道如下1.1kb DNA Ladder标准品；2.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒XhoI单酶切；3.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒KpnI单酶切；4.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒XhoI/KpnI双酶切；5.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒；6.100bp DNA Ladder标准品。图6显示了Trx-rhPTH融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳图。其中各泳道如下1.标准分子量蛋白；2.诱导前；3.诱导后。图7显示了Trx-rhPTH1-34融合蛋白的亲和柱层析结果。图8显示了Trx-rhPTH1-34融合蛋白经37℃、24小时酶切后的电泳图。其中各泳道如下A分子量标准蛋白；B酶切后样品；C酶切沉淀；D酶切前融合蛋白。图9显示了对PTH1-34纯品的电泳图。图10显示了对PTH1-34纯品的HPLC图。图11显示了在大鼠摘除卵巢性骨质疏松模型中，生理盐水治疗组严重骨质疏松。图12显示了在大鼠摘除卵巢性骨质疏松模型中，20μg·Kg-1·d-1PTH1-34治疗组大鼠骨质生成，骨结构恢复。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，发现对于PTH1-34这样的短肽而已，直接表达存在相当的困难，因为PTH1-34易受到宿主细胞内蛋白酶的水解。为了便于高表达PTH1-34和简便地纯化PTH1-34，本专利技术人将Trx基因和PTH1-34基因融合在一起，产生由氨基酸连接肽(linker)连接的Trx-PTH1-34的融合蛋白。在融合蛋白中，硫氧还蛋白对该融合蛋白的可溶性及稳定性非常重要。此外，连接肽中的6个连续组氨酸，可极大方便融合蛋白的纯化；连接肽中的DDDDK五肽既是连接肽，又是牛肠激酶特异性切割点，因此可以方便从融合蛋白上切下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件： （ａ）硫氧还蛋白元件，该元件具有硫氧还蛋白或其活性片段的氨基酸序列； （ｂ）甲状旁腺素ＰＴＨ１－３４元件，该元件具有人甲状旁腺素ＰＴＨ１－３４或其活性片段的氨基酸序列；以及 （ｃ）位于硫氧还蛋白元件和甲状旁腺素ＰＴＨ１－３４元件之间的连接肽序列，所述的连接肽含有６组氨酸标签序列和肠激酶酶切位点序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁邦，黎军，
申请(专利权)人：上海赛金生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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