本发明专利技术公开了亚洲1型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用。本发明专利技术通过酸压力筛选获得亚洲1型口蹄疫病毒P10和P15具有耐酸能力的两个代次病毒群,在分析这两个代次病毒群的突变序列的基础上，本发明专利技术采用反向遗传技术构建、拯救得到3株亚洲1型口蹄疫病毒耐酸突变株，其携带的衣壳蛋白的氨基酸序列分别为SEQ?ID?No.2、SEQ?IDNo.4或SEQ?ID?No.6所示。本发明专利技术解决了FMDV灭活疫苗生产和储存过程中病毒衣壳的酸敏感性问题，可为制备Asia1型FMDV灭活疫苗提供优质种毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)突变株,尤其涉及亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株，本专利技术进一步涉及该病毒突变株所携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用，属于口蹄疫病毒的防治领域。
技术介绍
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)是微 RNA 病毒科口蹄疫病毒属的成员，属于单股正链RNA病毒。FMDV的酸敏感性是病毒衣壳裂解所必需的。病毒进入细胞后，内体的酸性环境诱导病毒衣壳分解，从而使RNA基因组在感染细胞中被释放。在发展中国家，口蹄疫的防控主要是依靠灭活疫苗的免疫接种。对于口蹄疫疫苗来说，146S病毒粒子是灭活疫苗诱导中和抗体的最有效抗原。然而，FMDV对酸性环境极其敏感，在体外繁殖FMDV时，细胞代谢产酸很容易使得FMDV培养环境的pH下降，当pH值略低于中性条件时，FMDV的衣壳就会裂解，导致FMDV的有效抗原量降低，由此制备的灭活疫苗其免疫效力就会下降(Doel, T. R.，and W. K. Chong. 1982. Comparative immunogenicity of 146S, 75S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus. Arch Virol 73:185-191·)。此外，FMDV衣壳对温度也比较敏感，造成FMDV灭活疫苗运输和储存过程中需要完善的冷链系统，导致成本大幅上升。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株；本专利技术目的之二是提供所述亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株所携带的衣壳蛋白及其cDNA序列；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株亚洲I型口蹄疫病毒突变株rN17D，该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo. 2所示，衣壳蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示； 亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y，该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID No. 4所示，衣壳蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示。亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y/N17D，该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQID No. 6所示，衣壳蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示。本专利技术进一步公开了构建所述亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株rN17D、rH145Y以及rH145Y/N17D的方法；一种构建亚洲I型口蹄疫病毒突变株rN17D的方法，包括以下步骤(I)构建包含VPl N17D突变的全长重组质粒将SEQ ID No.1所示的rN17D核苷酸序列克隆到质粒ρΡΜ+S中得到阳性质粒pPM+S/N17D ;将该质粒用PstI和MluI酶切，将所收获的目的片段克隆到PAsi质粒，获得包含VPl N17D突变的全长重组质粒pN17D ；(2)将该包含VP1N17D突变的全长重组质粒pN17D线性化后，通过体外转录和转染，获得亚洲I 型口蹄疫病毒突变株rN17D。一种构建亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y的方法，包括以下步骤(I)将SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列扩增后用NdeI和PstI酶切，克隆到Asial 型FMDV的全长感染性克隆pAsi，得到重组质粒pH145Y ；(2)将该重组质粒pH145Y线性化后，通过体外转录和转染，获得亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y。一种构建亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y/N17D的方法，包括以下步骤(I)构建包含VPl N17D突变的全长重组质粒将SEQ ID No.1所示的rN17D序列克隆到质粒pPM+S中得到阳性质粒pPM+S/N17D ;将该质粒pPM+S/N17D用PstI和MluI酶切，将所收获的目的片段克隆到PAsi质粒，获得包含VPl N17D突变的全长重组质粒pN17D ；(2)将重组质粒pH145Y用NdeI和PstI双酶切后克隆到pN17D质粒中，获得重组质粒 PH145Y/N17D (Asial型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒);将该重组质粒pH145Y/N17D线性化后，通过体外转录和转染，获得亚洲I型口蹄疫病毒突变株rH145Y/N17D。本专利技术将用于构建、拯救亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株PH145Y/N17D的重组质粒pH145Y/N17D (即Asial型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒)提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为=CGMCC NO. 6603 ;保藏时间为2012年9月19日；该重组质粒的分类命名为=Asial型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒；保藏单位中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术将来自感染性克隆的Asial型FMDV Asial/YS/CHA/05毒株在pH5. O的PBS 缓冲液中作用后在BHK-21细胞上传代,筛选耐酸突变株；经分析，酸筛选的第10代(PlO) 和第15代(P15)病毒对pH5. O和pH6. O的酸性环境均具有一定的耐受性。这些实验结果表明，酸压力筛选获得的亚洲I型口蹄疫病毒PlO和P15这两个代次病毒具有耐酸能力，这两个代次病毒群中包含Asial型FMDV耐酸突变株。为了确定与耐酸性表型相关的氨基酸突变，本专利技术对耐酸毒株P10、P15及其亲本株的衣壳蛋白编码区进行序列比对，发现pH5. O 酸压力筛选至第10代的耐酸毒株存在四个氨基酸突变，分别是VPl N17D、VP2 H145Y、VP2 G192D和VP3 K153E;而第15代耐酸毒株只存在VPl N17D和VP2 G192D两个突变，另外两个突变消失。这些氨基酸发生突变，可能与Asial型FMDV的耐酸表型有关。因为酸压力筛选第10代病毒在pH7. 4和pH6. O条件下的TCID5tl滴度均比第15代病毒高，而且第10代病毒衣壳蛋白发生突变的数目(4个)比第15代病毒(2个)多。为分析这4个氨基酸突变与病毒耐酸表型的相关性，本专利技术选取第10代耐酸病毒所包含的突变氨基酸采用反向遗传技术构建并拯救突变体病毒，分别构建、拯救得到含有这些突变点的单一或组合突变的7 个病毒株，即rN17D、rH145Y、rG192D、rK153E、rH145Y/N17D、rG192D/N17D 和 rK153E/N17D。本专利技术对所构建、拯救的上述7个突变病毒株进行了耐酸性分析。分析结果发现， VPl N17D (A3310G)替换和VP2 H145Y (C2383T)替换对Asial型FMDV的耐酸表型起同样的关键作用；突变株rG192D和rK153E与亲本株对照Asial/YS/CHA/05 —样不具 有耐酸表型。 携带VPl N17D和/或VP2H145Y突变的其余5个突变病毒株(即rN17D、rH145Y、rH145Y/ N17D、rG192D/N17D、rK153E/N17D)均具有一定的耐酸性。随后，本专利技术用pH 5. O,pH 6. O和 pH 7. 4的条件处理拯救的突变株病毒，将病毒用Tris-HCL缓冲液(pH7. 6)中和后，测定病毒的感染滴度；本文档来自技高网...
【技术保护点】
亚洲1型口蹄疫病毒耐酸突变株，其特征在于：该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4或SEQ?ID?No.6所示。
【技术特征摘要】
2012.10.23 CN 201210405530.51.亚洲I型口蹄疫病毒耐酸突变株，其特征在于该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 6 所示。2.Asial型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒，其特征在于，其微生物保藏号是=CGMCC NO. 6603。3.权利要求2所述的Asial型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒在构建或拯救亚洲I 型口蹄疫病毒耐酸突变株中的用途。4.亚洲I型口蹄疫突变病毒的衣壳蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：于力，
申请(专利权)人：于力，
类型：发明
国别省市：
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