本发明专利技术公开了一种干扰素λ1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，证实IFN-λ1在体外对EV71感染的RD细胞具有良好的抑制病毒复制作用。同时，IFN-λ1不会抑制RD细胞生长，证实IFN-λ1对细胞是没有毒性的。IFN-λ1抑制EV71复制的作用效果与阳性对照Ⅰ型干扰素IFN-α比较近似甚至还要好些。IFN-λs（包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3）具有和Ⅰ型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性，并且能降低Ⅰ型干扰素引起的负作用，揭示IFN-λ1具有开发成抗EV71药物的前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及干扰素λ 1在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
技术介绍
新型肠道病毒是指近年来新发现的肠道病毒68 71型，为微小RNA病毒，具有肠道病毒的理化特性。新型肠道病毒可累及全身各个系统。新型肠道病毒感染在世界各国均有流行和传播，尤其是最近几年在东南亚和我国，婴幼儿中流行的手足口病主要是由肠道病毒 71 型(enterovirus type 71，EV71)引起。肠道病毒 71 型(enterovirus type 71， EV71)属于微小RNA病毒科人肠道病毒A血清型。EV71病毒主要感染婴幼儿，能引起婴幼儿手、足、口腔等部位出现疱疹等。少数能够引起严重的神经系统(包括脑心肌炎、肺水肿、 无菌性脑炎等)和呼吸系统疾病，甚至是死亡。由流行病学资料显示，EV71具有季节性但无地域性限制，近年来全世界各地不断有肠病毒流行的报告。但是目前尚无有效的抗EV71 病毒药物。而且大多数重症患儿病情进展迅速，在就诊时就已经发展成为严重的脑损伤，若不及时治疗很快会发展为致死性肺出血和肺水肿。有效抗EV71药物的发现和研制就显得更加迫切。EV71为正义单链RNA病毒，基因组约为7400bp。其中只有一个开放阅读框(ORF)， 被分为三个区域(Pl-P;3)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。其中Pl区编码四个结构蛋白 (VP4.VP2.VP3和VPl)，非结构蛋白由P2 (2A、2B和2C)和P3 (3A、3B、3C和3D聚合酶)区编码。在其两侧为5’和3’-非编码区(UTRs)，在3’非编码区的末端含有一个多聚腺苷酸尾巴(poly-Α)，可以调控病毒的复制。目前对VPl的研究较多，VPl蛋白暴露在外，通常是宿主中和抗体的目标，使得VPl基因长期处于免疫选择压力下。EV71基因组RNA的复制过程同其他正义RNA链病毒的复制过程相同经过几轮蛋白翻译后，病毒RNA作为模板合成负义 RNA链，后者随后又作为正义RNA链合成的模板。目前，基于结构特性、所使用的受体和生物学活性，干扰素可分为三大类1型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。其中根据I型干扰素的保守序列，又将其分为α，β， ω, κ , ε , τ , ζ , δ和ν亚型。II型干扰素仅有IFN-γ构成。III型干扰素由IFN-λ 1、 IFN- λ 2 和 IFN-λ 3 或白介素 19(IL_29)、白介素-28A(IL_28A)和白介素-28B(IL_28B) 所构成。基于其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，I型干扰素已被用于临床治疗，包括病毒感染如HCV和HBV、癌症如黑色素瘤以及多发性硬化症。但是I型干扰素会引起严重的负作用，包括流感样症状、骨髓抑制、胃肠道症状、自身免疫性失调诱导或加剧、神经毒性反应和情绪抑郁。I型干扰素的另一问题是，某些病人会产生I型干扰素抗性。IFN-λ s作为III型细胞因子家族新成员，具有和I型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。而且III型干扰素激活的基因似乎也与I型干扰素的相同。由于 IFN-λ s受体特异性表达模式，IFN-λ s可作为除I型干扰素外另一治疗选择，且能降低I型干扰素引起的负作用。Zymogenetics公司最近研发了 IL-四聚乙二醇形式(PEG-IL-29) 用于治疗病毒感染。临床Ia和Ib期研究结果似乎很客观，而且没有明显的免疫介导的负作用。因为中枢神经系统对IFN- λ s基本无反应，所以相对IFN- α/β , IFN- λ s的神经毒性很小。基于以上对于IFN- λ s的研究取得的成果，本专利技术想证实IFN- λ 1是否是有效的抗EV71病毒药物。目前还无相关文献报道IFN-λΙ与EV71的关系，但本专利技术的实验结果显示，IFN-λ 1可以作为一种有效的抗EV71的药物，具有很大的开发前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供IFN-λ 1在制备抗EV71病毒药物中的应用， 从而为临床上EV71病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的药物。在小鼠感染模型中，I型干扰素IFN- α能够保护小鼠抵抗EV71感染和抑制EV71 复制。关于三型干扰素IFN-λΙ和EV71复制间关系的研究还没有报道。采用体外细胞模型-RD细胞，来研究IFN-λ 1抑制病毒的复制等抗病毒机制。EV71感染RD细胞引起明显细胞致病作用(CPE)现象，而且明显上调了 IFN-λ ImRNA水平。为了研究RD细胞是否会对IFN-λ 1处理做出反应，我们检测了 IFN-λ 1受体的表达情况，结果显示RD细胞中 IFN- λ Rl和IL20RB mRNA表达水平要高于H印G2细胞O倍)。而且，IFN- λ 1对RD细胞几乎没有毒性作用，不会抑制细胞生长。因此，体外实验证明用IFN-λ 1作抗EV71病毒药物是对细胞没有毒性的。接着我们做了探索性的实验，用lOng/mL IFN-λ 1和30U/mL IFN-α分别处理 EV71感染的RD细胞，通过Real-time PCR和Western Blot检测发现，IFN- λ 1确实能降低细胞内以及上清中EV71拷贝数，说明IFN-λ 1具有抗EV71活性。随后我们研究了 IFN-λ 1抗EV71活性的剂量依赖性和时间效应。发现IFN-λ 1 对EV71复制的抑制具有一定剂量依赖性，50ng/mL IFN- λ 1处理后的效果最好。在25ng/ mL IFN- λ 1处理后，第18小时病毒抑制率达到最大，在实验时间内(32h)，IFN-λ 1都具有抗病毒活性。所有实验结果都说明，IFN-λ 1是一种很有潜力的抗EV71药物，可以用于制备抗 EV71药物。本专利技术也公开了抗EV71的药物，其中含有IFN-λ 1，其制备方法按制药工业现有技术制备。此外，我们建立快速检测EV71病毒拷贝数的方法。我们建立的Real-time PCR检测方法具有高度特异性，其灵敏度可达到10个拷贝数。自制标准品可靠、重复性高，且结果较好，节约了成本，省去了探针的设计以及探针法反应条件的摸索。为以后EV71病毒滴度检测提供了高效、灵敏和快捷的分子生物学检测方法。附图说明图1. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR检测特异性扩增曲线。图2. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR溶解曲线。三组独立实验中的线性一致。图3. EV71检测标准品STOR Green I实时荧光PCR标准曲线。图4. IFN-λ受体在H印G2和RD细胞中的表达。图5. EV71感染RD细胞后诱导IFN-λ ImRNA表达上升。图6. IFN- λ 1对RD细胞生长的影响。纵坐标为不同浓度IFN- λ 1处理后0D490 与正常RD细胞0D490的比值。图7. IFN- λ 1抑制EV71复制。(A)为细胞培养上清中EV71拷贝数；(B)RD细胞内 VPl蛋白表达情况。图8. IFN- λ 1对EV71复制的抑制具有剂量依赖性。㈧IFN- α (阳性对照)剂量梯度抑制EV71在RD细胞内的复制；(B)EV71感染的RD细胞培养物上清中病毒拷贝数变化； (C)EV71感染的RD细胞中VPl表达变化。图9. IFN- λ 1抑制EV71复制的时间梯度。(A)EV本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱应，吴建国，徐秀鹏，蔡艳艳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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