本发明专利技术提供一种重组鸡ＩＦＮ－γ基因的克隆表达及活性检测方法。步骤如下：以带有信号肽的重组质粒ＰＭＤ－１８Ｔ－ｐｒｅＩＦＮ－γ为模板，扩增无信号肽ＣｈＩＦＮ－γ基因片段；测序后的产物亚克隆到表达载体ｐＰｒｏＥＸＴＭＨＴａ上，将表达载体ｐＰｒｏＥＸＴＭＨＴａ－ＣｈＩＦＮ－γ转化表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ?ＤＨ５α中；对最佳诱导条件进行优化；本发明专利技术为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。用纯化重组ＣｈＩＦＮ－γ融合蛋白对肉仔鸡进行免疫，结果显示：ＣｈＩＦＮ－γ融合蛋白热应激条件下可以影响不同器官ＨＳＰ－７０的表达量，表明重组ＣｈＩＦＮ－γ融合蛋白推迟了ＨＳＰ－７０的产生，缓解了热应激带来的负面影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体说就是一种重组鸡IFN-Y基因的克隆表达及活性 检测方法。
技术介绍
近50年来，由于全球畜禽养殖业中抗生素的广泛使用，导致一些抗药性型细菌的 产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来极大的威胁。现在一些国家已明令禁止一些 抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，生产者们迫切需要一种既有效又有利于环保的 新方法来控制畜禽疾病.细胞因子可决定机体在感染疾病或疫苗免疫之后所发生的免疫 应答的类型及程度，是机体内天然的免疫反应调控因子。因此，细胞因子可望成为一种极具 前途的、可以替代传统抗生素的新型治疗方法。近几年来伴随大量的细胞因子基因被成功 克隆，细胞因子疗法在畜禽养殖业中的应用变得更加可行。由于鸡的免疫系统及其对微生 物感染和疫苗免疫的反应性类似于哺乳动物，因此鸡可以作为细胞因子控制集约化饲养条 件下的家畜疾病的研究及临床应用提供一个很好的实验动物模型。作为动物模型，鸡有易 于饲养、价格低廉、繁殖速度快、便于大批量处理等优点。由此可见，鸡细胞因子的研究不仅 在科研而且在实际应用中都具有深远的意义。干扰素首先它是一类多功能细胞因子。干扰素(Interference，IFN)是由培养的 细胞或动物体受到适宜的刺激时所产生的一种微量的、具有高度生物学活性的一类非特异 性抗病毒物质。英国科学家Aliek Isaacs和lean Lindenmann(1957年)利用鸡胚绒毛 尿囊膜研究流感病毒干扰现象时，从中获得了一种高活性多功能的糖蛋白，该蛋白能够抑 制流感病毒在绒毛尿囊膜细胞中的繁殖，他们称其为干扰素(Interferon，IFN)。Lampson 等(1963年)纯化了干扰素，证明其是分子量为20 34KD的蛋白质。近年来，干扰素一直 是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点，尤其是 IFN-Y，因为它在诱导并激活巨噬细胞产生杀伤力机制中是一种最重要的细胞因子。1973 年，Youngert和Salvin发现来自淋巴细胞培养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于以往 发现的IFN，遂命名为II型IFN。1980年国际干扰素命名委员会建议将各种干扰素先根据 动物的来源确定分类，再根据干扰素的抗原特异性和分子结构分成不同的型别。哺乳动物 的干扰素分为两类1型干扰素和II型干扰素。I型干扰素又主要包括IFN-a、IFN-3、 IFN-co和IFN-t，它们具有相关的结构并享用同一类受体，前3种主要是对病毒感染的应 答产生的，能诱导机体抗病毒蛋白的产生。II型干扰素又称免疫干扰素，即IFN-Y，是由活 化的T淋巴细胞在诱导剂的作用下产生的，与I型干扰素不享用同一类受体，对免疫系统有 调节作用，是哺乳动物的巨噬细胞活化因子。此时II型IFN就统一命名为IFN-y。在医学 界IFN-y作为一种免疫佐剂已取得了较好的成就，但到目前为止，人类对IFN-Y并不完全 明了，尤其是在我们畜牧生产中的应用更少之又少，对IFN-y进行进一步的研究，对于指 导畜牧生产具有重要的作用。在家禽养殖生产中，预防禽类传染性疾病主要采用疫苗免疫，但疫苗往往比较单3一，而病毒却复杂多样且变异快，常导致疫苗未能达到很好的免疫效果，严重的还能导致人 畜共患。在疾病的治疗方面常常又会因为大量使用药物引起一系列的药物残留和抗药性的 问题。因此研究一种新型的广谱抗感染类生物制剂就迫在眉睫。干扰素因其作用机理的独 特性而具有广谱的抗病毒活性和免疫增强作用。研究表明，重组干扰素与天然干扰素具有 同样的抗病毒和免疫调节活性，因此重组干扰素的研究和应用将成为家禽养殖生产中增强 鸡的免疫，减少鸡的疾病，降低鸡的死亡率的重要方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组鸡IFN- Y基因的克隆表达及活性检测方法。本专利技术的目的是这样实现的所述的重组鸡IFN-Y基因的克隆表达及活性检测 方法，步骤如下步骤一以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-Y为模板，扩增无信号肽 ChlFN- y基因片段，接着将PCR产物纯化回收后连接入克隆载体pMDIS-T，构建克隆载体 pMD18-T-ChIFN-Y，测序表明与Genebank提供的鸡IFN-Y基因序列同源性达100% ；步骤二 测序后的产物亚克隆到表达载体pProEXTMHTa上，将表达载体 pProEX HTa-ChIFN-Y 转化表达宿主 E. coli DH5 a 中，0.1mmol/L IPTG、30 °C 诱导 4h， 产生了与预期分子量为20. OkD的特异诱导表达条带，经蛋白质印迹分析，证明融合蛋白 ChlFN- y成功获得表达；步骤三对最佳诱导条件进行优化，在确定的最佳诱导条件下，既当菌体密度达到 0D600 = 0.6时开始诱导，0. 5mmol/L IPTG、30°C诱导4h，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的40%左右；步骤四将菌液超声裂解于4°C，12000Xg离心30min，分别取上清和沉淀进行 15%的SDS-PAGE可溶性分析，结果表明表达蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而 一部分在裂解沉淀中以包涵体的形式存在；利用Novagen公司纯化试剂盒对表达产物进行 纯化，经SDS-PAGE电泳，结果显示了良好的纯化效果，pProEX HTa-IFN- y得到了单一的目 的条带；将获得的洗脱液按照蛋白纯化仪中的脱盐程序进行脱盐，收集蛋白液，结果显示目 的蛋白和洗脱液里的盐成分分离成功；步骤五利用鸡成纤维细胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系统测定 天然纯化的rchlFN- y蛋白的抗病毒效价为1. 61 X 104U/mL ；步骤六将纯化的融合蛋白用PBS缓冲液稀释至100ii g/mL，在第14、21和28天 对肉仔鸡进行注射免疫(100 y g/只)，在28天免疫后对肉仔鸡进行48小时急性热应激，分 别在6、12、24和48小时取心脏、肝、肺、胸腺、脾和法式囊六个组织测定各组织中HSP70的 表达含量，试验结果表明，ChlFN- y对对HSP70具有抑制作用。本专利技术一种重组鸡IFN-Y基因的克隆表达及活性检测方法，采用原核表达系统， 成功表达了 ChlFN-Y融合蛋白，分子量约为20kD，与GenBank上发布的其他的ChIFN-Y基 因核苷酸序列进行比较，其同源率为100%;能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应。利 用鸡成纤维细胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系统测定天然纯化的rchlFN-Y 抗病毒活性效价为1.61X104U/mL，这为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定了良好的基础。用 纯化重组ChlFN-Y融合蛋白对肉仔鸡进行免疫，结果显示ChlFN-Y融合蛋白热应激条件下可以影响不同器官HSP-70的表达量，表明重组ChIFN-Y融合蛋白推迟了 HSP-70的产 生，缓解了热应激带来的负面影响。具体实施例方式下面对本专利技术作进一步说明。实施例1 本专利技术一种重组鸡IFN-Y基因的克隆表达及活性检测方法，步骤如 下步骤一以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-Y为模板，扩增无信号肽 ChlFN- y基因片段，接着将PCR产物纯化回收后连接入克隆载体pMDIS-T，构本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组鸡ＩＦＮ－γ基因的克隆表达及活性检测方法，步骤如下： 步骤一：以带有信号肽的重组质粒ＰＭＤ－１８Ｔ－ｐｒｅＩＦＮ－γ为模板，扩增无信号肽ＣｈＩＦＮ－γ基因片段，接着将ＰＣＲ产物纯化回收后连接入克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ，构建克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣｈＩＦＮ－γ，测序表明与Ｇｅｎｅｂａｎｋ提供的鸡ＩＦＮ－γ基因序列同源性达１００％； 步骤二：测序后的产物亚克隆到表达载体ｐＰｒｏ↑［ＥＸ］ＴＭＨＴ↓［ａ］上，将表达载体ｐＰｒｏ↑［ＥＸ］ＴＭＨＴ↓［ａ］－ＣｈＩＦＮ－γ转化表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、３０℃诱导４ｈ，产生了与预期分子量为２０．０ｋＤ的特异诱导表达条带，经蛋白质印迹分析，证明融合蛋白ＣｈＩＦＮ－γ成功获得表达； 步骤三：对最佳诱导条件进行优化，在确定的最佳诱导条件下，既当菌体密度达到ＯＤ６００＝０．６时开始诱导，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、３０℃诱导４ｈ，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的４０％左右； 步骤四：将菌液超声裂解于４℃，１２０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，分别取上清和沉淀进行１５％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可溶性分析，结果表明：表达蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而一部分在裂解沉淀中以包涵体的形式存在；利用Ｎｏｖａｇｅｎ公司纯化试剂盒对表达产物进行纯化，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，结果显示了良好的纯化效果，ｐＰｒｏ↑［ＥＸ］ＴＭＨＴ↓［ａ］－ＩＦＮ－γ得到了单一的目的条带；将获得的洗脱液按照蛋白纯化仪中的脱盐程序进行脱盐，收集蛋白液，结果显示目的蛋白和洗脱液里的盐成分分离成功； 步骤五：利用鸡成纤维细胞－新城疫（新城疫Ⅳ系弱毒苗）（ＣＥＦ－ＮＤＶ）系统测定天然纯化的ｒｃｈＩＦＮ－γ蛋白的抗病毒效价为１．６１×１０↑［４］Ｕ／ｍＬ； 步骤六：将纯化的融合蛋白用ＰＢＳ缓冲液稀释至１００μｇ／ｍＬ，在第１４、２１和２８天对肉仔鸡进行注射免疫（１００μｇ／只），在２８天免疫后对肉仔鸡进行４８小时急性热应激，分别在６、１２、２４和４８小时取心脏、肝、肺、胸腺、脾和法式囊六个组织测定各组织中ＨＳＰ７０的表达含量，试验结果表明，ＣｈＩＦＮ－γ对对ＨＳＰ７０具有抑制作用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：单安山，代丽，郑燕斌，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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