本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法和应用。由肠道病毒71型引起手足口病，发生重症感染的比例较大(病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿)，病死率也较高可达10％-25％，EV71-IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒，可用于EV71感染的诊断。EV71-IgM检测已有相关文献报道，多是EV71病毒培养物作为包被抗原的间接ELISA，特异性、灵敏度和稳定性方面尚存诸多不足；由于病毒培养成本高，效率低，无法大量供应市场。本发明专利技术克服上述不足，提供一种临床检验急需、操作简便、适合各医疗疾控部门使用的检测人血清中EV71-IgM的试剂盒及其制备方法和应用。技术方案是首先将血清加入到微孔板中，其中的IgM抗体被预包被在微孔板上的抗μ链捕获，未结合的其他成分被洗涤除去，第二步，加入酶标记物，被捕获的IgM中的EV71-IgM会与HRP标记的EV71重组抗原特异性的结合，洗涤后，HRP会和后续加入的底物反应。最终达到检测EV71-IgM抗体的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
肠道病毒EV71型感染是由人肠道病毒71型(EV71)引起的疾病的总称，临床上主要表现为手足口病，手足口病多在婴幼儿中爆发流行，部分EV71感染患儿表现为疱疹性咽峡炎，重症患者出现病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。引起手足口病的病原，最常见的是柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型；由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高，重症病例病死率可达10% -25%，因此病原学诊断意义重大。肠道病毒71型(EV71)基因组为含有大约7. 5Kb的单股正链RNA，包括5’端非编码区、3’端非编码区和由P1、P2、P3所组成的多蛋白，共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4，7 个非结构蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中 VP1、VP2、VP3 暴露于病毒外壳的表面，为EV71主要的抗原变异位置；VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关；3C则参与大部分的蛋白裂解反应； 3D为RNA聚合酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；28、2(、3々、；^等四种蛋白则与病毒RNA的复制有关。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VPl是EV71病毒的主要中和决定因子，因此VPl蛋白被认为是最适合来建立ELISA方法的抗原。肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面一是临床表现，二是血清学证据， 三是病原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。EV71感染产生终生免疫保护，感染后可检出IgM和 IgG抗体。IgM试剂是最适于临床近期感染诊断的重要指标。EV71-IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，是一种科学、方便、经济的EV-71感染的血清学检测方法。肠道病毒71型抗体(IgM)的检测已有相关文献报道，基本上是以肠道病毒71型的病毒培养物为抗原作为包被抗原的间接ELISA，试剂盒在特异性、灵敏度和稳定性方面尚存诸多不足之处；并且，由于病毒培养成本高，效率低，无法大量供应市场。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服上述不足，提供一种临床检验急需、操作简便、 适合各医疗疾控部门使用的可检测人血清或血浆中肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒及其制备方法和应用。本专利技术提供了一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒，其组分包括抗人-IgM(y链)单克隆抗体预包被的微孔板、辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒 71型抗原、阳性对照、阴性对照、标本稀释液、浓缩洗涤液(20X)、底物液A、底物液B和终止液。本专利技术的技术方案是首先将血清样本加入到微孔板中，样本中的IgM抗体被预包被在微孔板上的抗人-IgM(y链)单克隆抗体吸附(捕获)，未结合的其他成分(包括特异的IgG抗体)将被洗涤除去，第二步，加入肠道病毒71型抗原酶标记物，被捕获的IgM中的EV71-IgM会与蜡根过氧化物酶标记的EV71重组抗原特异性的结合，洗去其他未结合物， 辣根过氧化物酶会和后续加入的底物反应。最终达到检测EV71-IgM抗体的目的。本专利技术的另一个目的是提供了一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤1.抗人-IgM(y链)单克隆抗体预包被微孔板的制备1.1 包被0.05mol/L(0.05毫摩尔/升)，pH9. 6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲系统，加入适量抗人_IgM(u链)单克隆抗体，混勻后按每孔IOOul (微升)加入到微孔板中，37°C放置2小时， 室温过夜，然后甩去孔内液体，拍干；1.2 洗涤0. 01mol/L PBS-T (0. 01毫摩尔/升磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲系统，0. 05 %的 Tween-20), pH7. 2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重复洗涤一次，拍干。1.3 封闭0. 01mol/L PBS，10 %小牛血清，0. 25 %酪蛋白，0. 1 %硫柳汞钠，pH7.2，按每孔力口入IlOul的量加入到微孔板中，37°C放置2小时，然后甩去孔内液体，拍干；1.4 干燥封闭后的微孔板，甩去孔内液体拍干后，放置于干燥室(相对湿度小于45% )过夜，然后放入有干燥剂的铝箔袋中封口，保存于2 8°C环境。2.酶标抗原工作液的制备0. 01mol/L PBS，10 % 小牛血清，0. 25 % 酪蛋白，l/1000Proclin300，pH 7. 2 的 buffer中加入适量辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒71型VPl抗原，保存于2 8°C环^Ml O3.阳性对照的制备取A45tl值彡2. 0的抗EV71_IgM阳性多份人血清混勻，用56°C水浴锅加热120分钟，用0. 01mol/L PBS, 20% BSA, pH 7. 2的buffer调整到A450值> 1.0，加入万分之五的硫柳汞钠，保存于2 8°C环境。4.阴性对照的制备取A450值< 0. 1的抗EV71_IgM阴性多份人血清混勻，用56°C水浴锅加热120分钟，自然冷却后，加入万分之五的硫柳汞钠，保存于2 8°C环境。5.底物液ANa2HPO4. 12H20 18g柠檬酸·H205g乙酸钠9. 25g乙酸1. 2ml Na2O25g 去离子水 IOOOml，pH5. 06.底物液B先用5mlDMS0 (二甲亚砜)溶解0. 25g TMB (3，3，5，5-四甲基联苯胺)；取IOOOml 去离子水加入约Iml浓盐酸，混勻后pH2. 5，将TMB溶液加入到盐酸溶液中混勻。7.终止液浓硫酸IOOml去离子水800ml8. 20X浓缩洗涤液Na2HPO4. 12H2058gNaH2PO48gNaCL160gTween-2010. Oml去离子水1000ml，调整pH7. 2本专利技术的又一个目的是提供了一种人血清中肠道病毒71型抗体(IgM)测定方法， 本专利技术的试剂盒在使用时可以按下列步骤操作1.取出试剂盒置室温平衡30分钟。将20X洗涤液用蒸馏水做20倍稀释。2.加样品取出包被板，作好标记，留1孔空白对照，其余加入阴性对照3孔阳性对照2孔50ul/孔及待测标本50ul/孔于相应的反应板孔内，空白对照不加。将反应板轻轻震荡混勻后，用封板膜封板，置37°C温箱或水浴中反应30分钟。3.洗板温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30 秒钟。4.加酶标工作液每孔加入50ul酶标工作液，空白孔除外。5.温育用封板膜封板后，置37°C温箱或水浴中反应30分钟。6.洗板温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30 秒钟。7.显色每孔加入底物A、B液各50ul，震荡混勻，用封板膜封板后，置37°C温箱或水浴中反应15分钟8.终止每孔加入终止液50ul，轻轻震荡混勻。9.测定设定酶标仪波长于450nm(建议双波长450/630nm检测)，测定各孔A450 值。注意在终止反应3本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种肠道病毒７１型抗体（ＩｇＭ）的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒包括抗人－ＩｇＭ（μ链）单克隆抗体预包被的微孔板、辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒７１型抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液（２０×）、底物液Ａ、底物液Ｂ和终止液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：常延滨，邵育晓，
申请(专利权)人：北京贝尔生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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