本发明专利技术公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其用途，属于生物技术领域。试剂盒采用原核表达的重组P30蛋白作为包被抗原，依据间接ELISA原理检测猪血清中非洲猪瘟病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为原核表达的重组P30蛋白，其具有良好的抗原性。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒包括P30蛋白包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体、浓缩洗涤液、血清稀释液、TMB底物、终止液。本发明专利技术试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测试剂盒，属于生物
具体而言，本专利技术涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途。
技术介绍
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100%，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、 /K月中及脏器出血。(Wi lliam, Hess Adv. African swine fever a reassessment . Vet Sci Comp Med，1981，25 :39 69)世界动物组织(ΟΙΕ)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999,21 ) :117 119)。本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007 年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为1701Λ 1901Λ，中央有1251Λ左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafael，Yancz, Javier Μ, et al. Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus . Virology, 1995, 208 :249 279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个 0RF，可以编码150 200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，观(11) :42 43)。非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性。实验证明，P30蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量约为36KD。
技术实现思路
本专利技术公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查。本专利技术还提供了一种P30基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。本专利技术还提供了一种兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。本专利技术的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。上述用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒包括所述ELISA板条每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P30蛋白，规格为8孔X 12 条；所述血清稀释液和浓缩洗涤液血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；所述底物显色液即用型TMB显色液，50mL ；所述终止液2mol/L的溶液，50mL ；所述酶标多克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；阳性对照；阴性对照。所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明本专利技术的技术方案如下一、抗原制备1.非洲猪瘟P30蛋白的表达根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV) P30基因序列，设计合成了 1对引物，采用PCR方法从ASFV DNA中扩增出P30基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒 PET-P30，测序验证后转化入表达宿主菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达。设计的引物为P30-1-5，-GCGGATCCTAATTTTAAAATTGAATGGAT-3 ‘P30-2-5，-GTCTCGAGCCCAATCAAAATTAGATAACT-3 ‘下划线部分为引入的酶切位点，P30-1为ASFV P30基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI ；P30-2为ASFV P30基因下游扩增引物，引入的酶切位点为)(hoI。2.非洲猪瘟P30蛋白的纯化诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声ls，间隔 ls，共IOmin)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD值见表1。纯化后P30蛋白的OD值为2. 25，与标准品比较后，其浓度为1700yg/ml。表IBCA法测定标准品蛋白含量权利要求1.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ELISA法检测非洲猪瘟病毒抗体。2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述ELISA板条每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P30蛋白，规格为8孔X 12条； 所述血清稀释液和浓缩洗涤液血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；所述底物显色液即用型TMB显色液，50mL ； 所述终止液2mol/L的溶液，50mL ；所述酶标单克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100 倍稀释；阳性对照； 阴性对照。4.权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺，其特征在于采用辛酸-硫酸铵法纯化猪血清IgG，制备纯化的猪IgG，并用此纯化IgG免疫家兔，制备兔抗猪Ig本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的兔抗猪ＩｇＧ多克隆抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ＥＬＩＳＡ法检测非洲猪瘟病毒抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈文刚，董志珍，王涛，
申请(专利权)人：陈文刚，
类型：发明
国别省市：12
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