本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型抗原检测试剂(胶体金法)及其制备方法和应用。肠道病毒71型引起手足口病，发生重症感染的比例较大(病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿)，病死率也较高可达10％-25％，本发明专利技术用于EV71感染的快速诊断。病毒分离和RT-PCR是最早用于EV71病毒病原检测的方法，但由于操作难度大、费用高等缺点，不适合基层临床使用。本发明专利技术克服上述不足，提供一种临床检验急需、操作简便、适合各医疗疾控部门使用的可检测人咽试子、泡液、血清或粪便中EV71抗原的试剂及制备方法和应用。技术方案是将标本一滴在样品垫上，其中的EV71抗原与金标垫中金标EV71多抗结合，沿层析膜迁移，被检测线捕获胶体金颗粒聚集形成肉眼可见红线，达到检测EV71抗原的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型抗原检测试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
肠道病毒EV71型感染是由人肠道病毒71型(EV71)引起的疾病的总称，临床上主要表现为手足口病，手足口病多在婴幼儿中爆发流行，部分EV71感染患儿表现为疱疹性咽峡炎，重症患者出现病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。引起手足口病的病原，最常见的是柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型；由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高，重症病例病死率可达10% -25%，因此病原学诊断意义重大。肠道病毒71型(EV71)基因组为含有大约7. 5Kb的单股正链RNA，包括5’端非编码区、3’端非编码区和由P1、P2、P3所组成的多蛋白，共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4，7 个非结构蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中 VP1、VP2、VP3 暴露于病毒外壳的表面，为EV71主要的抗原变异位置；VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关；3C则参与大部分的蛋白裂解反应； 3D为RNA聚合酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；28、2(、3々、；^等四种蛋白则与病毒RNA的复制有关。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VPl是EV71病毒的主要中和决定因子，因此VPl蛋白被认为是最适合来建立ELISA方法的抗原。肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面一是临床表现，二是血清学证据， 三是病原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。EV71感染后可在咽部会分泌物、粪便和皮疹的疱液中排除病毒，本专利技术利用胶体金免疫层析双抗体夹心法快速检测标本中EV71病毒抗原，是一种科学、方便、经济的EV-71感染的病原学检测方法。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于EV71病毒的检测诊断的方法，这种方法具有较高的特异性，但由于技术操作难度大、 周期长，不适合临床使用。RT-PCR技术用于检测病毒RNA，具有快速、简便的优点，而且还有很高的灵敏度和特异性。但其灵敏度一方面依赖于患者携带的病毒与所用引物的匹配性， 另一方面也受到扩增片断的高级结构的很大影响。已有相当多的努力想寻找对不同基因型均通用的引物及扩增条件，但结果都不如人意，其主要原因在于EV71各亚型编码区间的变异较大，常常几个碱基的差别就会造成扩增效率的明显变化。另外，RT-PCR本身对于操作环境及操作人员的要求较高，并且价格昂贵，因此难以在广大基层单位中使用。目前市场上仅少数单位具备RT-PCR能力，且难以找到通用引物，目前所用引物具基因型特异性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服上述不足，提供一种临床检验急需、操作简便、适合各医疗疾控部门使用的可检肠道病毒71型抗原的胶体金试纸条及其制备方法和应用。本专利技术提供了一种肠道病毒71型抗原的胶体金试纸条，该试纸条具有高度的特异性和灵敏度，而且操作简便，快速，无需专门设施。本专利技术的另一目的是为了提供一种检测肠道病毒71型抗原的胶体金试纸条的制备方法，该方法简单、稳定性和重复性好，便于大批量生产。本专利技术的主要目的可通过如下措施来实现一种肠道病毒71型抗原金标试纸条，包括一底衬(1)、该底衬(1)上面的中部粘贴一层析膜G)，该层析膜中部有一条包被抗EV71抗原VPl单克隆抗体的检测线(6)和一条包被羊抗兔IgG多克隆抗体的质控线(7)，层析膜(4)的左右两端分别粘贴一涂覆有金标记兔抗EV71病毒抗原多克隆抗体的玻璃纤维膜为胶体金垫(3)和吸水纸(5)；胶体金垫 (3)的下端上面粘贴一样品垫O)，在胶体金垫C3)和样品垫( 上面分别粘有一层不干胶纸的保护层(8)，该保护膜由底衬的边缘折返粘于底衬的背面。本专利技术也可以将上述未粘贴保护膜的试纸条每一条装入一特制的长方形塑料盒中，为肠道病毒71型抗原金标试纸检测卡，塑料盒由盒底和盒盖组成。盒底中央有一凹槽， 将上述试纸条放入其中；盒盖上有一长方形检测孔(10)和一圆形样品孔(9)。样品孔用于滴加实验样品，其下方是试纸条的样品垫；检测孔一侧的盒盖上印有T和C两英文大写字母，对应试纸条的检测线和质控线，通过检测孔可以观察到层析膜上检测线和质控线的变化。本专利技术的另一个目的是提供了一种肠道病毒71型抗原金标试纸条的制备方法， 该方法包括下列步骤1.胶体金标记兔抗EV71病毒抗原多克隆抗体的金标垫的制备。1. 1.金标抗体的制备1. 1. 1胶体金的制备采用公知的柠檬酸还原法，得到粒径在40纳米左右的胶体金颗粒。1. 1. 2EV71病毒多克隆抗体制备用细胞培养EV71裂解物纯化(由⑶C病毒病所提供)后多次免疫新西兰大白兔，ELISA检测效价大于1 20000时收集兔血，4°C过夜取血清，经ftOtein A柱亲和层析纯化后，得到成品兔抗EV71病毒多克隆抗体。1. 1. 3金标抗体的制备在IOOml胶体金溶液中加入3. 1. 2制备的多抗l_5mg ； 再加入IOml浓度10%的氯化钠溶液，低速离心去除沉淀；上清高速离心后，得沉淀物溶于 PH7. 2的PBS缓冲液中，上凝胶层析柱收集活性峰得到成品金标抗体原液。1. 2将1. 1. 3制备的金标抗体原液溶于PH7. 2的Tris-HCL缓冲液中，含0. BSA 和0. 02%的叠氮钠，调整到吸光度A530为80，得到金标抗体工作液，用喷膜机将金标抗体工作液喷涂到玻璃纤维膜上，然后在37°C下干燥得金标垫(3)。2.层析膜上检测线和质控线的制备将抗EV71抗原VPl单克隆抗体和羊抗兔多抗分别配制成包被液，用喷膜机喷涂在层析膜(4)上形成检测线(6)和质控线(7)，放置于37°C干燥箱(相对湿度小于45% )2小时，然后放入有干燥剂的铝箔袋中封口，保存于2 8°C环境备用。3.肠道病毒71型抗原金标试纸条制备3. 1将胶体金垫、样本垫和吸水纸根据底衬和底衬上层析膜的尺寸裁成合适的长^^ ο3. 2将胶体金垫粘贴在底衬上层析膜检测线一侧，与层析膜有l_2mm的重叠。3. 3将样品垫一边与底衬边缘对齐、另一边覆盖2mm胶体金垫粘贴在底衬上。3. 4将吸水纸粘贴在底衬上层析膜质控线一侧，与层析膜有l_2mm的重叠，制成金标试齐Ll大卡。3. 5 切割3. 5. 1首先，在金标试剂卡两端的样品垫和吸水纸上分别粘贴一层保护膜，再用切膜机将金标试剂卡切割成宽度2_4mm的试纸条(见图2)，放入有干燥剂的铝箔袋中封口，储存于室温2-30°C。3. 5. 2也可不贴保护膜，将金标试剂卡直接用切膜机切割成宽度2-4mm的试纸条，每一条放入一个特制的塑料卡盒中为检测卡(见图3)，放入有干燥剂的铝箔袋中封口， 储存于室温2-30°C。本专利技术的又一个目的是提供了一种人中肠道病毒71型抗原测定方法，本专利技术的试剂在使用时可以按下列步骤操作1.取出检测卡平放在实验台上，做好标记。2.标本处理及加样2. 1咽试子标本将咽试子放入500ul病毒提取液中，搅动咽试子，使上面的病毒尽量释放出来。I本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种肠道病毒７１型抗原检测试纸条，其特征在于有一底衬（１）、该底衬（１）上面的中部粘贴一层析膜（４），该层析膜（４）中部有一条包被抗ＥＶ７１抗原ＶＰ１单克隆抗体的检测线（６）和一条包被羊抗兔ＩｇＧ抗体的质控线（７），层析膜（４）的左右两端分别粘贴一涂覆有金标记兔抗ＥＶ７１病毒抗原多克隆抗体的玻璃纤维膜为胶体金垫（３）和吸水纸（５），胶体金垫（３）在检测线（６）一侧，吸水纸（５）在质控线（７）一侧；胶体金垫（３）的下端上面粘贴一样品垫（２）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：常延滨，郭四新，
申请(专利权)人：北京贝尔生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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