本发明专利技术舒述了用缺乏Ｌ－丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株，特别是从广泛可利用的亲本微生物如：大肠杆菌，得到的这种突变菌株生产色氨酸的方法．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是有关用缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株生产色氨酸的方法。下面称之为L-丝氨酸脱氨酶，它的活性本质与尿酸梭菌分离出的一种酶相似。它已被命名为EC4，2，1，14，下面称之为L-丝氨酸脱氨的活性，参见卡特(Carter J·F·)和塞耶斯(Sa-yers·R·D)的文章“尿酸梭菌”、发表在细菌学杂志(J·Bacte-rial)109期，757-763页(1972年)。专利技术特别与利用L-丝氨酸脱氨酶(L-SD)活性缺乏的大肠杆菌K12的几个突变菌株有关。用微生物从碳水化合物中生产L-色氨酸现有技术中有两种方法来完成。第一个是选择抗色氨酸及类似物的反馈物的野生型微生物的突变菌株。这种方法的例子包括抗-5氟色氨酸的一个枯草芽杆菌的菌株(Bacillus substilis)。(见美国专利4，363，875)抗5-甲基色氨酸的短杆菌属的一些种(Brevi bacterium)(见美国专利3，700，539);及其它需要苯丙氨酸和酪氨酸，並且抗4-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-氟色氨酸、酪氨酸-氧酸盐(酯)和苯丙氨酸-氧酸盐(酯)的各氨酸棒杆菌(ATCC21851)。后一个菌株可以利用15克/10毫升甘蔗赤糖糊密糖转化的蔗糖生产出16.8毫克/升的色氨酸。第二个增加色氨酸生产的方法是提供一个质粒和几个质粒上携带控制色氨酸生物合成遗传信息给宿主微生物。后一个方法的例子是美国专利4，371，614所述的通过携带色氨酸生物合成信息的质粒转化缺乏色氨酸酶的大肠杆菌宿主〔EC4、1，99，1〕。不论用于色氨酸合成的微生物是一个突变菌株还是转化菌株，色氨酸都是通过下列途径合成的图表1 邻氨基苯甲酸是在色氨酸生物合成途径的第一个主要前体。生产色氨酸的最后一步是色氨酸合成酶参与了一个吲哚-3-磷酸甘油分子和一个丝氨酸分子缩合，成色氨酸和3-磷酸甘油醛。人们发现，在微生物中通过吲哚-3-磷酸甘油集中起来的色氨酸前体库是很多的。丝氨酸的供应决定着色氨酸的生产率。一般丝氨酸生物合成是沿下列途径进行的。图表23-磷酸甘油酸3-磷酸羟基丙酮酸3-磷酸红氨酸(叶酸)丝氨酸 甘氨酸L-丝氨酸脱水酶丙酮酸(L-丝氨酸脱氨酶)丙酮酸乙酰辅酶A丝氨酸在几条途径里被消耗。一条是丝氨酸通过四氢叶酸反应转化成甘氨酸。另一条主要降解途径是L-丝氨酸脱氨酶作用于丝氨酸导致产生丙酮酸和乙酰辅酶A。在尿酸梭菌中，L-丝氨酸脱氨酶被认为是尿酸发酵途径的一种酶。该酶一般在一系列丝氨酸生成和它作为主要碳素代谢部分的进一步代谢活动中起作用。L-丝氨酸脱氨酶的水平随着氮素营养，碳源和氨基酸可利用程度而改变。L-丝氨酸脱氨酶活动的诱导物是很具特征性的。这些诱导物包括氮素的缺乏，甘氨酸和亮氨酸的存在(但不是丝氨酸，因为它不影响甘氨酸和亮氨酸的诱导)，和在葡萄糖基本培养基上的生长。在生产氨基酸最廉价的葡萄糖基本培养基上培养，L-丝氨酸脱氨酶的水平是高的。(参见纽曼(Newman F·B·)和卡普尔(Kapo-or·V·的文章“大肠杆菌K12菌株中L-丝氨酸脱氨酶活性的离体研究”刊载在加拿大生化杂志(Can·J·Biochem·)58期，1292-1297页，(1980年)。据信它通过脱氨作用导致细胞内丝氨酸水平的下降，保持丝氨酸库处于低水平，避免了丝氨酸对L-苏氨酸脱氨酶的抑制作用。(参见伊森伯格(Isenberg'S·)和纽曼(NewmanE·B·)的文章“大肠菌K12菌株中L-丝氨酸脱氨酶的研究”，载在细菌学杂志118期，53-58页(1974年)。可以肯定的是在有L-丝氨酸脱氨酶存在时，大肠杆菌K12菌株不可逆地把L-丝氨酸转化为丙酮酸或者一个和丙酮酸处于同一氧化水平的化合物。既使L-丝氨酸脱氨酶的一个自然底物，它也能在生理上有意义的反应中被L-丝氨酸脱氨酶降解(参见纽曼(Newman'E·B·)和沃克(Wa-lker'C·)文章“在大肠杆菌K12菌株中L-丝氨酸的降解L-丝氨酸，甘氨酸和亮氨酸联合作为碳源”，刊载在细菌学杂志151期777-782页(1982年)。丝氨酸对色氨酸生物合成或丝氨酸发酵生产的可利用性可以通过利用缺乏丝氨酸降解酶的微生物得到加强。叶酸盐缺乏的微生物从代谢的观点来看过于应激反应以致于在培养中不能继续维持。然而，缺乏L-丝氨酸脱氨酶的微生物可以继续培养，并用来，并用来作为加强色氨酸生物合成的微生物来源。L-丝氨酸脱氨酶缺乏活性的微生物在色氨酸生产中的有用性特别是体现在那些被修饰为增强色氨酸生产的微生物。例如，一些在美国专利4，371，614中被揭示的微生物，其中用携带色氨酸生物合成信息的质粒转化了的色氨酸酶活性缺乏的大肠杆菌K12菌株在生产色氨酸时就比未加修饰的大肠杆菌菌株产量高得多。在这些菌株中色氨酸生产的限制因子是L-丝氨酸的降解及是否通过微生物合成它或是否通过L-丝氨酸脱氨酶从外源来供应它。在美国专利4，371，164揭述的菌株及其它为增加色氨酸生产而修饰了的菌株可以通过在L-丝氨酸脱氨酶缺乏活性的菌株中生长的噬菌体P，用它转导产生色氨酸的菌株，再筛选出降低L-丝氨酸脱氨酶活性的转导体或增加色氨酸生产或二者兼有之的转导菌株进一步增加色氨酸的生产。专利技术者制造和分离了一些微生物菌株，特别是革兰氏阴性菌，像L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏或几乎没有的大肠杆菌。术语“L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏菌株”在此是指微生物中L-丝氨酸脱氨酶活性低于野生型亲本的菌株。(L-丝氨酸脱氨酶活性的测定是用后面例子中描述的方法进行的)。根据这个定义，L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏菌株中该酶活性在5个毫单位或更低(在后面的例子中确定)。L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏的大肠杆菌菌株不能在含丝氨酸，甘氨酸或亮氨酸的基质上生长，当它生长在葡萄糖基本培养基上缺乏L-丝氨酸脱氨酶的活性。根据本专利技术，大肠杆菌K12菌株暴露在紫外线照射或利用增变噬菌体Mu的dx转座子(Mudx)插入到大肠杆菌K12菌株后的转座子诿变再适当的培养基上筛选出缺乏L-丝氨酸脱氨酶的突变菌株。根据专利技术所叙述的程序提供了一个从广泛可利用的微生物中制造和分离缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株的方法。这些可以利用的微生物包括革兰氏阴性菌如大肠杆菌。图Ⅰ是一个表示不同氨基酸的不同浓度与181-34菌株产量关系的曲线图。图Ⅱ是质粒PD2643内切酶切点图解。从下面例子我们可以更好地理解专利技术。例Ⅰ1、MEW128菌株的分离一个在ilva部分缺失的野生型大肠杆菌CU1008菌株是从美国密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院威廉斯先生(L·S·Wi-lliams)处得到的。MEW 128菌株用紫外光照射CU1008菌株，再根据戴维斯(Davis'B·D·)等人的方法在含青霉素并含丝氨酸2毫克/毫升，甘氨酸200微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的葡萄糖培养基上在37℃下继代培养。(参见“用青霉素分离生化缺陷型细菌”，刊在美国化学协会杂志70卷4267页(1948)。把残存者转移到葡萄糖基本培养基，用影印法筛选并在添加了如上配方中含量的丝氨酸，甘氨酸、和亮氨酸的细菌甲琼脂(Bacto-Agar)培养基上培养(称之为SGL-平板培养基)。MEW128菌株由于不能在SGL-平板上生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产Ｌ－色氨酸的方法，其特征是利用缺乏Ｌ－丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株。
【技术特征摘要】
1.一种生产L-色氨酸的方法，其特征是利用缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的突变菌株是几乎没有L-丝氨酸脱氨酶活性的菌株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的突变菌株含有一个与L-丝氨酸脱氨酶活性有关的结构基因突变。4.根据权利要求3所述的方法，其特征是其中的结构基因突变是一个插入突变。5.根据权利要求4所述的方法，其特征是其中的插入突变是插入了抗氯霉素和氨苄青霉素的噬菌体Mudx·(Mudx CAM(APrlac)6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的突变菌株含有一个与L-丝氨酸脱氨酶活性有关的调节基因突变。7.根据权利要求6所述的方法，其特征是其中的调节基因突变是一个插入突变。8.根据权利要求7所述的方法，其特征是其中的插入突变是插入了抗氯霉素和氨苄青霉素的噬菌体Mudx(Mudx CAM(APrlan)9.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的突变菌株含有一个与L-丝氨酸脱氨酶活性有关的结构基因突变和一个与该酶活性有关的调节基因突变。10.根据权利要求9所述方法，其特征是其中所说的与L-丝氨酸脱氨酶有关的结构基因突变是一个插入突变。11.根据权利要求10所述方法，其特征是其中所说的结构基因的插入突变是插入了抗氯霉素和氨苄青霉素的噬菌体Mudx(Mudx CAM(APrlac))。12.根据权利要求9所述方法，其特征是其中所说的与L-丝氨酸脱氨酶有关的调节基因突变是一个插入突变。13.根据权利要求9所述方法，其特征是其中所说的调节基因的插入突变是插入了抗氯霉素和氨苄青霉素的噬菌体Mudx(Mudx CAM(APrlac))。14.根据权利要求1所述方法，其特征是其中所用的突变菌株是属于大肠杆菌的一些种(Escherichia Coli)。15.根据权利要求14所述方法，其特征是其中所用的大肠杆菌是K12菌株。16.根据权利要求1所述方法，其特征是其中所用的菌株是需要硫胺素的菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊莱恩纽曼，
申请(专利权)人：斯托弗化学有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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