本申请涉及目前被索引为５型ＰＩＶ（ＰＩＶ－５或ＰＩＶ５）和２型ＰＩＶ（ＰＩＶ－２或ＰＩＶ２）的副流感病毒（ＰＩＶ）的融合蛋白（Ｆ蛋白）的突变蛋白。本申请涉及由其衍生的产物，如核酸，载体，细胞，抗体、适体、干扰ＲＮＡ类型的融合抑制剂；骨髓瘤、杂交瘤；干细胞和祖细胞。本申请还涉及突变蛋白和由其衍生的产物在医疗和生物技术应用中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及副流感病毒(PIV)融合蛋白(F蛋白)的突变蛋白，副流感病毒目前被索引为 5 型 PIV (PIV-5 或 PIV5)和 2 型 PIV (PIV-2 或 PIV2)。本申请还涉及由其衍生的产物，如 核酸、载体、细胞； 抗体、适体、干扰RNA类型的融合抑制剂； 骨髓瘤、杂交瘤； 肝细胞和祖细胞。本申请还涉及这些突变蛋白和由其衍生的产物在医药和生物技术应用中的用途。
技术介绍
目前被索引为5型PIV (PIV-5或PIV5)的副流感病毒(PIV)，是副粘病毒科 (paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的包膜病毒。以前PIV-5被称为SV5 (猿病毒幻，因为它最初是从原代猴细胞培养物分离的。然而，PIV-5的天然宿主看起来是狗， 其在狗中引起称为犬舍咳的咳嗽。随后，从收集自人类但是培养于动物细胞中的样品获得几个PIV-5分离物。此外， 在人类中没有症状与PIV-5相关。因此，人类实际上是否是PIV-5的宿主的问题，仍然处于热烈的争论中。目前，无论如何，都认为Ρ ν-5病毒是动物病毒。目前被索引为2型PIV(PIV_2或PIV2)的副流感病毒(PIV)也是副粘病毒科腮腺炎病毒属的包膜病毒。目前，仅仅鉴定了人类的PIV-2分离物(hPIV-2)，因此，认为PIV-2是人类病毒。PIV-5和PIV-2病毒在核酸序列、蛋白序列、组织、结构和形态方面彼此非常相似。因为选自人副流感病毒，因此PIV-2与在人类中发现的PIV-5最密切。可以认为PIV-2是PIV-5的人类等同物，至少本专利技术人是这么认为的。PIV-5或PIV-2感染导致称为合胞体的多核结构形成，合胞体是由感染的宿主的细胞融合形成的。PIV-5和PIV-2病毒通过病毒包膜与细胞膜的融合进入宿主细胞。该融合涉及两种病毒糖蛋白血细胞凝集素-神经酰胺酶附着蛋白(HN)和融合蛋白(F)0PIV-5和PIV-2的融合蛋白F以简单前体(FO)的形式合成，并且采用糖基化的同型三聚体形式。PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要宿主的宿主弗林蛋白酶的蛋白水解切割， 以产生由通过二硫键连接的两个亚基组成的“预激活”形式大羧基末端亚基Fl和小氨基末端亚基F2。亚基Fl由疏水融合肽(FP)以及具有卷曲螺旋型构象的两个7个重复结构域 (HR-1和HR-2)组成。在被HN激活后，融合蛋白经历一系列构象变化，导致融合肽插入靶细胞膜中。接着，在使病毒包膜接近细胞膜的HR-I和HR-2结构域之间发生相互作用(Russellet al，2006)。已知这些结构域形成非常稳定的一束由三聚体卷曲螺旋结构组成的六螺旋， 在该六螺旋中，三个HR-I结构域与三个HR-2结构域在反平行方向上相连。这种构象代表了 F 蛋白的融合后形式(Baker et al, 1999, Sergel-Germano et al,2000, West et al, 2005)。PIV-5和PIV-2的融合蛋白F需要用于促进融合的来自相同病毒类型的HN蛋白 (Yao et al，1997)。然而，存在于F和HN之间的相互作用的确切本质，仍然没有完全清楚。然而，几项研究已经表明，PIV-5和PIV-2的某些毒株的不同之处在于，它们需要 HN触发融合。作为实例，Ito et al，1997描述了〃 SV5〃(PIV-5)的两株毒株，即W3A和WR，它们的F蛋白的差异仅在于三个氨基酸(残基22、443和516)。W3A毒株的F蛋白能以自主方式诱导融合，即在缺少HN蛋白的情况下，而WR毒株的F蛋白不能如此。Ito et al，1997指出，WR毒株的F蛋白的融合活性可通过以氨基酸脯氨酸取代该蛋白位置22的氨基酸再次建立。Ito et al，2000认为，W3A和WR毒株F蛋白的位置132的氨基酸E和位置四0的氨基酸A可能参与这些毒株的F蛋白成为自主HN蛋白的能力。Paterson et al，2000指出，W3A毒株F蛋白位置22的氨基酸脯氨酸的存在，以及 WR毒株F蛋白氨基酸443的存在，能够增加这些病毒毒株的融合能力。Russell et al，2003指出，用芳族氨基酸取代毒株W3A的F蛋白的残基L447和 1449，能够增加该病毒毒株F蛋白的融合活性。Gardner and Dutch，2007 指出，野生型〃 SV5〃(PIV-5)病毒 F 蛋白的突变 I49A应具有促融合作用。Gardner et al，2007指出，野生型〃 SV5" (PIV-幻病毒F蛋白的突变V402A应具有促融合作用。对于蛋白PIV-2，看起来不存在描述将所述类型的突变引入该病毒F蛋白的序列中以便试图据此增加自主性和融合能力的现有技术文献。此外，存在许多能融合的其他病毒蛋白，如流感蛋白HA1/HA2、棒状病毒G蛋白或 HIV 的 gp41/gpl20 蛋白。有关这些不同病毒蛋白的融合性能力和自主性的现有知识仍然非常有限。无论如何，有关病毒融合蛋白的现有知识未能提供设想有效医疗和/或生物技术应用的充分技术知识。专利技术_既述本专利技术人认为，拥有可用的高融合性且在融合能力方面表现出实质自主性的融合蛋白，能够为若干的医疗和生物技术情况提供了解决方案。本专利技术人因此从一系列其他病毒融合蛋白选择性地选择了 PIV-5和/或PIV-2的 F蛋白，所述其他病毒融合蛋白如来自流感的HA1/HA2蛋白、来自棒状病毒的G蛋白或来自 HIV 的 gp41/gpl20 蛋白。然后构建它们，并产生在缺少HN蛋白的情况下能够融合的突变的F蛋白。已证实，本专利技术的突变蛋白具有高融合能力和高自主性。它们不需要HN蛋白的存在来诱导细胞融合和合胞体形成。本专利技术人还证明，将不同于F蛋白在其天然状态下所呈现的切割位点的切割位点特别是组织特异性切割位点弓I入这些突变蛋白中是可能的。本专利技术人还提出了本专利技术的突变蛋白和/或衍生于所述蛋白的产物或所述蛋白的后续产物的医疗(治疗、预防、缓和还有诊断)和/或生物技术应用。具体而言，本专利技术人提出使用本专利技术的突变蛋白或编码它们的核酸来体内或离体治疗、预防或减轻疾病或功能障碍，如癌症(特别是转移性癌，优选转移性黑素瘤)或胎盘发育缺陷，对这些疾病或功能障碍而言，诱导或增加合胞体形成是期望的。本专利技术人还提出，用阻断PIV-5和/或PIV-2的F蛋白的试剂，如抗体、重组树突细胞、反义细胞、siRNAs、核酸适体，来体内或离体治疗、预防或减轻疾病或功能障碍，如包膜病毒感染、过敏反应、自身免疫病或移植排斥，对这些疾病或功能障碍而言，抑制或阻断合胞体形成是期望的的。本专利技术人还提出了检测合胞体形成过量或相反形成不足的诊断手段。本专利技术人还特别为筛选能减少合胞体形成的活性成分提出了不同的生物技术手段。本专利技术人还提出了包含本专利技术突变蛋白的癌细胞，特别是骨髓瘤。本专利技术人还提出了包含本专利技术突变蛋白的杂交瘤。本专利技术的癌细胞特别是骨髓瘤能与另一细胞特别是与 B淋巴细胞融合，而无需使用聚乙二醇(PEG)，也无需使用电穿孔，也无需使用任何其他融合诱导手段。本专利技术的癌细胞，特别是骨髓瘤，能自主融合。本专利技术的杂交瘤可以通过融合(B淋巴细胞与黑素瘤的融合)产生，不需要使用聚乙二醇(PEG)、也无需使用电穿孔、也无需使用任何其他融合诱导手段本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．突变蛋白，其氨基酸序列包含通过以下方式衍生于ＰＩＶ－５或ＰＩＶ－２病毒的Ｆ蛋白序列的序列：●通过：○氨基酸Ｐ取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置２２或在所述ＰＩＶ－２Ｆ蛋白序列中位于位置２４的的氨基酸；以及○氨基酸Ｅ取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置１３２或在所述ＰＩＶ－２Ｆ蛋白序列中位于位置１３３的氨基酸；以及○氨基酸Ａ取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置２９０或在所述ＰＩＶ－２Ｆ蛋白的序列中位于位置２９４的氨基酸；以及○氨基酸Ｐ取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置４４７或在ＰＩＶ－２Ｆ蛋白序列中位于位置４４５的氨基酸；●和通过○选自Ｖ、Ｉ、Ｌ优选Ｖ的疏水氨基酸取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置１４７或在所述ＰＩＶ－２Ｆ蛋白序列中位于位置１５１的氨基酸；和／或○选自Ｖ、Ｉ、Ｌ优选Ｖ的疏水氨基酸取代在所述ＰＩＶ－５Ｆ蛋白序列中位于位置１５８或在所述ＰＩＶ－２Ｆ蛋白序列中位于位置１６２的氨基酸；●和任选地○通过由另一酶促切割位点取代所述Ｆ蛋白的天然切割位点，和／或通过将除了所述Ｆ蛋白的天然切割位点以外的酶促切割位点插入所述Ｆ蛋白；和／或○通过使所述Ｆ蛋白的Ｃ末端部分缺失，所述Ｃ末端部分从所述蛋白Ｃ末端的最后氨基酸开始在Ｎ末端方向上延伸，但是延伸不超出所述Ｆ蛋白的ＨＲ２结构域。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：曼纽尔·梅尔基奥·让皮埃尔·罗萨卡拉特拉瓦，
申请(专利权)人：国家科研中心，
类型：发明
国别省市：FR
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