本发明专利技术提供酸性纤维母细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor；aFGF)组合物，其包含：(i)SEQ ID NO:1的aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)的SEQ ID NO:1的aFGF、(iii)具有N端葡糖酰化(gluconoylation)的SEQ ID NO:1的aFGF、(iv)SEQ ID NO:2的aFGF及(v)SEQ ID NO:3的aFGF，或其组合。本发明专利技术亦提供经修饰的酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)，其具有N端磷酸葡糖酰化或葡糖酰化。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的人类酸性纤维母细胞生长因子及其组合物
本专利技术涉及具有磷酸葡糖酰化或葡糖酰化的经修饰的酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)。本专利技术亦关于aFGF组合物，其包含：(i)SEQIDNO:1的aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖酰化的SEQIDNO:1的aFGF、(iii)具有N端葡糖酰化的SEQIDNO:1的aFGF、(iv)SEQIDNO:2的aFGF及(v)SEQIDNO:3的aFGF，或其组合。
技术介绍
酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)，其影响各细胞类型的体外的增生及分化，是最初分离自神经组织(包括全脑及下视丘)的单链蛋白质。aFGF为肝素依赖性促分裂原(heparin-dependentmitogen)且其可强结合至所有四种已知的FGF受体及其剪接形式。其可位于与运动及感觉功能相关的神经元的特定亚群内，且可纯化自成人大脑。经纯化的aFGF为神经母细胞的促分裂原，并可促进脊髓神经元的轴突延伸。此外，aFGF经证实于培养时促进星状细胞(astrocytes)的神经生长因子表现。数个研究报告，FGFs对神经生理活性具有范围广泛的效用，不同于其于体内中枢神经系统(centralnervoussystem；CNS)内的促分裂作用。举例而言，当投予大脑时，aFGF可对大脑缺血所诱发的下视丘CA1神经元退化提供保护效用(SasakiK.etal.,BrainRes.Bull.33:505-511,1994)。FGF1据报告具有保护选择性神经元群体，对抗与神经退化性疾病如阿兹海莫氏症(Guo,Z.,andMattson,M.,Cereb.Cortex10,50-57,2000)及HIV脑炎(Everall,I.P.etal.,J.Neuropathol.Exp.Neurol.60,293-301,2001)相关的分子的神经毒性的效用。原生人类aFGF多肽是由154个氨基酸组成，其分离自人类大脑。然而，经确认，人类aFGFN端的19个氨基酸与人类介白素-1(interleukin-1；IL-1)具有同质性。与IL-1的氨基酸一致或类似的原生人类aFGFN端的19个氨基酸可导致相同的内源性免疫反应，包括巨噬细胞活化，以及调节细胞生长停滞(G.Venkataramanetal.,P.N.A.S.,96:3658-63,1999)。此外，据报告，促发炎性细胞激素IL-1及FGF-1(aFGF)/FGF-2(bFGF)具有相同结构骨架，且竞争酪氨酸激酶结构域的相同受体结合位(A.J.Minteretal.,J.CellPhysil.,167:229-37,1996)。数种重组型人类aFGF于商业上可购，且广泛用于各种生物试验。举例而言，具有140个氨基酸的重组人类aFGF(R&D，aa16-155，目录编号：232-FA/CF)、具有154个氨基酸的重组人类aFGF(R&D，aa2-155，目录编号：231-BC/CF)、具有141个氨基酸的重组人类aFGF(Sigma，天然序列并具有额外的甲硫氨酸残基连接至N端，目录编号：F5542)。亦参见OsakadaFetal.,NatProtoc.2009；4(6):811-24，及ChristinaKrabbeetal.,J.Neurochem.(2009)110,1908–1920。此外，美国专利号7,956,033(于2011发布)揭示一具有135个氨基酸的经修饰的人类aFGF，其呈现增进的稳定性，包含通过删除原生人类aFGFN端的20个氨基酸的缩短的原生人类aFGF，并于缩短的原生aFGF之前加上丙胺酸(Alanine；Ala)。
技术实现思路
在一方面，本专利技术提供酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)组合物，其包含：(i)SEQIDNO:1的aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖酰化的SEQIDNO:1的aFGF、(iii)具有N端葡糖酰化的SEQIDNO:1的aFGF、(iv)SEQIDNO:2的aFGF及(v)SEQIDNO:3的aFGF，或其组合。在本专利技术的一具体实施例中，aFGF组合物具有下列高效能离子交换层析(highperformanceion-exchangechromatography；HPIEC)尖峰：尖峰滞留时间(min)118.2218.5319.1419.4519.9其中该HPIEC于下列条件进行：流速：0.5mL/min样本量：100μL管柱：ProPac离子交换管柱吸光值：220-280nm溶析设定：缓冲液A：20mMMES，pH6.0-8.0缓冲液B：20mMMES+1MNaCl，pH6.0-8.0时间(min)缓冲液A(％)缓冲液B(％)0955595515455525406030208040955另一方面，本专利技术提供经修饰的酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)，其具有N端磷酸葡糖酰化或葡糖酰化。根据本专利技术，相较于SEQIDNO:1的人类aFGF或野生型人类aFGF，该aFGF组合物及经修饰的aFGF呈现增进的特异活性。附图说明配合附图阅读可更佳地理解前文的概述以及如后的本专利技术的详细说明。在附图中：图1显示aFGF135(SEQIDNO:1)样本的HPIEC轮廓。图2A-图2C提供aFGF135、aFGF140、及aFGF154的HPIEC轮廓。图2A显示aFGF135的HPIEC轮廓、图2B显示aFGF140的HPIEC轮廓、及图2C显示aFGF154的HPIEC轮廓。图3显示aFGF135样本的HPIEC轮廓的五个尖峰样本的特异活性。具体实施方式除非另行定义，本文使用的所有技术性及科学性术语具有与本专利技术所属领域中的本领域技术人员一般所理解相同的意义。除非另有明确指明，本文使用的单数形式“一”、及“该”包括复数指涉物。因此，举例而言，提及“一样本”时是包含复数个此类样本及本领域技术人员已知的其等同物。本文所使用的“酸性纤维母细胞生长因子”或“aFGF”术语是指肝素依赖性促分裂原，且其可强结合至所有四种已知的FGF受体及其剪接形式，包括任何类型的aFGFs，优选为人类aFGF，其可为原生、野生型、或经修饰的aFGF。在一优选具体实施例中，该aFGF具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，如美国专利号7,956,033所揭示的，其在此并入本申请作为参考数据。本专利技术意外发现，相较于无磷酸葡糖酰化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)组合物，其包含：(i)SEQ ID NO:1的aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation)的SEQ ID NO:1的aFGF、(iii)具有N端葡糖酰化(gluconoylation)的SEQ ID NO:1的aFGF、(iv)SEQ ID NO:2的aFGF及(v)SEQ ID NO:3的aFGF，或其组合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.07 US 61/887,6191.一种经分离的酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)，其氨基酸序列由SEQIDNO:1所组成，且其N端经磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylated)，其特征是其高效能离子交换层析(highperformanceion-exchangechromatography；HPIEC)在滞留时间18.2分钟有一个尖峰，其中该HPIEC系于下列条件进行：
流速：0.5mL/min
样本量：100μL
管柱：ProPac离子交换管柱
吸光值：220-280nm
溶析设定：
缓冲液A：20mMMES，pH6.0-8.0
缓冲液B：20mMMES+1MNaCl，pH6.0-8.0
时间min
缓冲液A％
缓冲液B％
0
95
5
5
95
5
15
45
55
25
40
60
30
20
80
40
95
5
。
2.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雅惠，
申请(专利权)人：雅祥生技医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71
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