一种干细胞制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物治疗领域，公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，所述干细胞制剂对糖尿病足有良好的疗效。本发明专利技术公开的干细胞制剂，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白。本发明专利技术公开了所述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述脂肪干细胞、所述纤维母细胞和所述纤连蛋白和溶剂混合，制得所述干细胞细胞制剂。本发明专利技术还公开了所述干细胞制剂或所述制备方法制得的干细胞制剂在制备糖尿病足中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物治疗领域，特别涉及一种干细胞制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
糖尿病(diabetesmellitus，DM)发病率在世界范围内上升，已成为继心血管疾病及肿瘤后的第3大非传染性疾病。糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一。糖尿病足是指糖尿病患者足部由于神经病变使下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而发生溃疡和坏疽的疾病状态。1972年，Catterall首先提出了糖尿病足(diabeticfoot，DF)发病的三大因素：血管闭塞性缺血、感染以及神经病变。其中，血管病变是一个重要因素。它不仅是导致DM患者足部感染的主要病因，而且也是影响糖尿病足部溃疡(diabeticfootulcer，DFU)预后的最重要因素。Loomans等的研究结果显示，糖尿病患者在代谢紊乱的状态下，血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell，EPC)的数量减少且有功能障碍，影响其增殖、黏附及血管生成。糖尿病的高胰岛素血症导致了血管内皮祖细胞的增殖和存活能力的减低，因此，在糖尿病等一些疾病状态下，血管内皮祖细胞的数量和功能两方面均有所降低。血管内皮祖细胞的功能状态异常导致血管再生能力减弱，这可能是引起糖尿病血管病变的基础，同时也是此类疾病预后差、治疗困难的原因之一。此外，由于糖尿病患者机体持续处于高血糖与蛋白质的非酶糖化状态，引起脂代谢紊乱。使血液持续处于高粘稠、高凝状态，因此患者下肢动脉较容易发生血管壁增厚、管腔狭窄等血管病变，进而导致不同程度的微循环障碍，出现下肢供血逐渐减少，最终发生组织损伤，从而导致糖尿病足等并发症产生。目前DF对各种治疗方法不敏感，治疗效果不佳，预后不良，病变恶化易导致截肢。DF的传统治疗方法有药物治疗、血管搭桥、局部涂抹中药及介入治疗，但是手术和介入治疗对患者的选择要求较高，有严格的指征，导致许多自身条件欠佳或合并有重要脏器严重病变而不能耐受搭桥手术及介入治疗的中老年患者只能选择药物治疗，而这些治疗方法的远期效果均不理想且不能从根本上解决问题，很多患者最终无法避免截肢的厄运。因此，各国研究者在不断地探索并寻找出更好的非药物的治疗方案，以此来提高糖尿病足患者的治疗效果。干细胞是一类具有自我复制功能力的多潜能细胞，在一定条件下，能够分化成多种功能的细胞。近年来，干细胞技术飞速发展，其在糖尿病治疗中的基础研究和临床应用也得以迅速开展，干细胞研究给糖尿病足的治疗带来新的希望。脂肪干细胞是一种多向分化的干细胞，并发现它能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞系类型,具有易获得、易扩增、不易衰老等特点。近年来，大量的研究表明脂肪干细胞可以产生和分泌多种促血管化的细胞因子(如VEGF、HGF、bFGF等),并参与了组织损伤修复的血管化过程，并具有造血支持作用、抗凋亡作用、趋化作用等。纤维母细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体。纤维母细胞的主要功能是：合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，纤维母细胞的减少也是引起皱纹产生的重要原因。纤连蛋白也称纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)，一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。大量国内外的研究结果证明，FN分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的FN具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的FN可以相互替代使用。FN主要功能是介导细胞粘着，纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。糖尿病足的治疗目前主要是控制血糖改善微循环等保守治疗效果不理想，因其病变特点是远端血管流出道差，故即使搭桥、介入均难再通。因此，研发一种对糖尿病足有良好疗效的干细胞制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，所述干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。本专利技术公开了一种干细胞制剂，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；所述脂肪干细胞的含量为4×106～1×108个/ml；所述纤维母细胞的含量为2×106～5×107个/ml；所述纤连蛋白的含量为0.4～1.5μg/ml。优选地，所述干细胞制剂包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；所述脂肪干细胞的含量为8×106个/ml；所述纤维母细胞的含量为5×106个/ml；所述纤连蛋白的含量为0.5μg/ml。本专利技术公开了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述脂肪干细胞、所述纤维母细胞、所述纤连蛋白和溶剂混合，制得所述干细胞制剂。优选地，所述溶剂为生理盐水。优选地，所述脂肪干细胞的制备方法包括以下步骤：a1)、在无菌条件下抽取脂肪组织；a2)、在无菌条件下用清洗液清洗脂肪组织，用眼科剪刀将脂肪组织剪成0.2-0.3cm3的小块，再用D-Hank’s液清洗；a3)、用Ⅰ型胶原酶消化脂肪块20min，离心收集脂肪细胞；a4)、以5000个/cm2的密度将步骤a3)收集的脂肪细胞进行接种培养，培养三天后将细胞用0.25％胰酶消化后再以5000个/cm2的密度继续接种培养；a5)、收集培养至第三代的脂肪干细胞，用生理盐水重悬制得所述脂肪干细胞的悬液。优选地，步骤1)抽取的脂肪组织为腹部皮肤下的脂肪组织。选择腹部皮下部位进行脂肪组织的抽取既方便取材，又不影响个体的生命健康。抽取脂肪组织的部位并不限于腹部皮下组织，也可选择其它部位进行脂肪组织抽取。优选地，步骤2)所述的清洗液为D-Hank’s液。优选地，所述纤维母细胞的制备方法包括以下步骤：b1)、在无菌条件下取皮肤组织块；b2)、清洗皮肤组织块后用眼科剪刀剪成小块，再进行清洗；b3)、用Ⅰ型胶原酶对步骤b2)得到的皮肤组织块进行低温消化过夜，第二天转移置37℃至消化完全；b4)、加入培养液，离心后去上清，再加入培养液混匀后进行培养，每3天换一次液；当第一代细胞达到80％的汇合度时传第二代；当第二代细胞达到80％的汇合度时传第三代；当第三代细胞达到85％的汇合度时，收集培养的细胞，用生理盐水重悬制得所述纤维母细胞的悬液。优选地，步骤b3)所述的低温为4℃。本专利技术还公开了所述干细胞制剂和所述制备方法制得的干细胞制剂在治疗糖尿病足中的应用。在本专利技术公开的干细胞制剂中，纤维母细胞能促进创口的愈合，脂肪干细胞不仅在坏死端能发挥修复功能，而且对患者机体的微环境有一定的改善作用。纤连蛋白能增强细胞间粘连及细胞基质粘连，促进血小板附着于血管受损部位，达到修复的作用。本专利技术建立了糖尿病足的大鼠动物模型，对本专利技术公开的干细胞制剂和本专利技术公开的制备方法制得的干细胞制剂进行了动物试验，动物试验的结果显示本专利技术公开的干细胞制剂和本专利技术公开的制备方法制得的干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。综上所述，本专利技术公开的干细胞制剂和本专利技术公开的制备方法制得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞制剂，其特征在于，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；所述脂肪干细胞的含量为4×106～1×108个/ml；所述纤维母细胞的含量为2×106～5×107个/ml；所述纤连蛋白的含量为0.4～1.5μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞制剂，其特征在于，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；所述脂肪干细胞的含量为4×106～1×108个/ml；所述纤维母细胞的含量为2×106～5×107个/ml；所述纤连蛋白的含量为0.4～1.5μg/ml。2.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；所述脂肪干细胞的含量为8×106个/ml；所述纤维母细胞的含量为5×106个/ml；所述纤连蛋白的含量为0.5μg/ml。3.权利要求1或2所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述脂肪干细胞、所述纤维母细胞、所述纤连蛋白和溶剂混合，制得所述干细胞制剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为生理盐水。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的制备方法包括以下步骤：a1)、抽取脂肪组织；a2)、用清洗液清洗所述脂肪组织，用眼科剪刀将所述脂肪组织剪成0.2-0.3cm3的脂肪块，再用清洗液清洗；a3)、用Ⅰ型胶原酶消化脂肪块20min，离心收集脂肪干细胞；a4)、以5000个/cm2的密度将步骤a3)收集的脂肪干细胞进行接种培养，培养三天后将细胞用0....

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，黎娟妹，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44