大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原及其构建方法和应用。重组抗原氨基酸如序列表Seq ID No.1中所示。所述重组抗原碱基如序列表Seq ID No.2中所示。本发明专利技术通过基因工程方法将凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)氨基酸序列进行合理化改变，并将该序列进行优化后通过大肠杆菌表达系统高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原及其构建方法和应用。
技术介绍
随着社会的不断发展以及人口老龄化的进程，血栓性疾病已经成为发病率和死亡率均较高的一种疾病，它严重威胁了患者的健康与生命，现已受到研究人员的广泛关注，成为国内外医学的研究重点。血栓性疾病的发生主要与机体内凝血和纤溶系统的失衡有关。凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombinactivatedfibrinolysisinhibitor，TAFI)是体内纤溶系统的重要组成成分，它是由肝脏合成，含有423个氨基酸残基，分子量约为56kD的单链糖蛋白。在血液中，TAFI以没有活性的酶原形式存在，当出现凝血后，TAFI被凝血酶调节蛋白、纤溶酶和蛋白酶等激活成有活性的TAFIa。TAFIa在血液凝固和纤维蛋白溶解的平衡中发挥着重要作用，它可以切除纤维蛋白羧基端Arg或Lys，抑制纤溶蛋白酶原的激活，从而降低纤溶酶的激活，具有下调纤溶系统的功能。天然来源的TAFI资源有限，DNA重组技术为TAFI的商品化生产提供了一种经济有效的方式，DNA重组技术是将外源基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入受体内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的分子克隆技术。目前许多蛋白已经通过基因重组技术在多种异源宿主中成功表达。大肠杆菌表达系统是表达异源重组蛋白应用最为广泛的系统，与其他表达系统如酵母表达系统等相比，其具有能在较短的时间内高水平地表达多种蛋白、发酵条件易掌控和表达成本低等优势。天然TAFI序列直接转入大肠杆菌表达系统中进行表达，会产生无活性的包涵体形式。包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体。因此，通过基因工程方法将目的蛋白通过大肠杆菌表达系统直接表达成有活性的可溶性蛋白是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原及其构建方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原，重组抗原氨基酸如序列表SeqIDNo.1中所示。所述重组抗原碱基如序列表SeqIDNo.2中所示。一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原的制备方法：步骤(1)在经密码子优化的SeqIDNo.2所示基因序列两端设计酶切位点，分别为BamHI和XhoI，将该基因连接在pET-41a(+)载体上，得到重组载体(pET41a-p.MD-TAFI)；步骤(2)将步骤(1)所得构建成功的重组表达载体pET41a-p.MD-TAFI转化到大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌，将所得重组大肠杆菌经培养纯化，得重组抗原。进一步，(1)种子培养：将所述重组产凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的重组大肠杆菌接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，摇床转速150～200r/min；(2)液体培养：将经过步骤(1)培养所得活化种子液按体积百分比3～10％的接种量接种至表达培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时，摇床转速150～200r/min；而后再于20～30℃振荡诱导培养14～22h，摇床转速150～200r/min表达完毕；(3)粗提重组抗原：将步骤(2)所得表达液离心；收集上清液，即为胞外粗提重组抗原；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗提重组抗原。所述表达培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl20～0.83g，KCl0～0.186g，ZnCl20～0.186g，50％的甘油0～20％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20％，其余成分为0.25mol/LTris-HCl。所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl9～11g，其余成分为水。所述步骤(2)活化种子液经表达培养基，于30～37℃振荡培养后，向培养基中添加诱导剂，进行诱导培养；其中，诱导剂的添加量为每升所述表达培养基0～5g。一种高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原的工程菌，将所述重组载(pET41a-p.MD-TAFI)转化到大肠杆菌感受态细胞，即获得高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原的工程菌。所述工程菌经高效表达获得凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原。本专利技术所具有的优点：本专利技术通过基因工程方法将凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)氨基酸序列进行合理化改变，并将该序列进行优化后通过大肠杆菌表达系统高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原。其中，采用的重组质粒所获得的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原显示出较高的活性，为在工业水平生产出高活性的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)奠定了基础。附图说明图1为野生凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)和优化凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因的比对图。图2为优化后与优化前蛋白结构预测图，a为优化后预测图，b为优化前预测图。图3为培养皿阳性克隆。白色圈注为符合要求的阳性克隆菌株。图4为优化后与优化前表达产物电泳对比图，其中，M为蛋白标准，1-2为优化氨基酸后的TAFI表达沉淀和上清液，3-4为优化前的沉淀和上清液。图5为重组菌所表达的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的纯化结果图，其中，M为蛋白标准；1为纯化的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)；2为诱导的12h上清液。具体实施方式下述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。本专利技术根据大肠杆菌密码子的偏好性，优化凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因，连接到表达载体上，并在大肠杆菌中实现了表达。其步骤为：A、优化氨基酸：根据经验，将目的蛋白部分氨基酸序列进行优化；B、密码子优化：根据大肠杆菌密码子的偏好性，优化凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因并合成该序列；C、凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因的制备：由公司根据优化序列合成目的基因。D、重组质粒的构建：经BamHI和XhoI酶切得大小为1203bp的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)片段，将其克隆到高拷贝质粒pET-41a(+)上，得到重组质粒pET41a-p.MD-TAFI；E、工程菌的构建：用转化方法将质粒pET41a-p.MD-TAFI导入到E.coilBL21(DE3)，进行表达。实施例1凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因密码子的优化1)根据大肠杆菌密码子的偏好性表和经验，对凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)基因密码子的优化，优化碱基序列为SeqIDNo.2所示(优化的凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)由生物技术有限公司合成)，结果如图2所示。S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原，其特征在于：重组抗原氨基酸如序列表Seq ID No.1中所示。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原，其特征在于：重组抗原氨基酸如序列表SeqIDNo.1中所示。2.按权利要求1所述的大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原，其特征在于：所述重组抗原碱基如序列表SeqIDNo.2中所示。3.一种权利要求1所述的大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原的制备方法，其特征在于：步骤(1)在经密码子优化的SeqIDNo.2所示基因序列两端设计酶切位点，分别为BamHI和XhoI，将该基因连接在pET-41a(+)载体上，得到重组载体(pET41a-p.MD-TAFI)；步骤(2)将步骤(1)所得构建成功的重组表达载体pET41a-p.MD-TAFI转化到大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌，将所得重组大肠杆菌经培养纯化，得重组抗原。4.按权利要求3所述的大肠杆菌高效表达凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)重组抗原的制备方法，其特征在于：(1)种子培养：将所述重组产凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的重组大肠杆菌接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，摇床转速150～200r/min；(2)液体培养：将经过步骤(1)培养所得活化种子液按体积百分比3～10％的接种量接种至表达培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时，摇床转速150～200r/min；而后再于20～30℃振荡诱导培养14～22...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文欣，金雪花，刘峰，
申请(专利权)人：辽宁迈迪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21