来源于东方蜜蜂的赛卡品肽制造技术

本发明专利技术提供了来源于东方蜜蜂的赛卡品肽，更具体地说，涉及表现出纤溶酶抑制活性、弹性蛋白酶抑制活性、抗细菌和抗真菌作用的肽，从而用于广泛的应用，例如凝血剂、抗炎剂、抗细菌或抗真菌剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来源于东方蜜蜂(Apis cerana)的赛卡品(secapin)肽。
技术介绍
蜜蜂在经济上是重要的昆虫。蜜蜂不仅携带花粉而且提供许多产品例如蜂蜜、蜂王胶、蜂胶、花粉、蜂蜡和蜂毒等。这些蜂产品是东方医学常用和重要的材料。最近，已经进行了蜂毒中组分的药理作用的许多调查研究。蜂毒包括不同的蜂毒蛋白或肽，具体而言，蜂毒肽、磷脂酶A2(PLA2)、蜂毒明肽、透明质酸酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂等是相关领域中已知的。更具体而言，在多种生物体的毒液中发现的这类各种蛋白质或肽吸引了高的兴趣，因为它们参与各种生理活性例如免疫应答、补体活性、止血、凝血机制、纤溶功能、减轻炎症等等。编码赛卡品肽的碱基序列在1984年被初次鉴定，赛卡品肽是西方蜜蜂Apis mellifera的蜂毒组分之一[Vlasak R&Kreil G，Eur J Biochem 145：279-292(1984)]。还报告了与膜翅目昆虫包括一些种类的蚂蚁和埃及伊蚊有关的另一种碱基序列。然而，因为已知作为蜂毒组分之一的赛卡品肽，在蜂毒中以不超过1％的小份额存在，相当难以分离和得到它。为了这个原因，对赛卡品的各种生理影响的研究数量比较少。因此，本专利技术人进行了编码来源于东方蜜蜂即Apis cerana的赛卡品肽的cDNA基因的克隆。另外，本专利技术人已经发现，通过将在所述cDNA基因之中编码成熟肽的多核苷酸插入载体中、然后将该载体引入昆虫的细胞系中所产生的重组肽可以抑制纤维蛋白溶解酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的活性，并表现出
优异的对抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和昆虫病原真菌的抗细菌和抗真菌作用，从而完成本专利技术。[现有技术文献][非专利文献](非专利文献No.0001)Vlasak R&Kreil G，Eur J Biochem 145：279-282(1984)
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供来源于东方蜜蜂的赛卡品肽‘东方蜜蜂源性赛卡品肽’)。本专利技术的另一个目的是提供编码上述肽的核苷酸。此外，本专利技术的另一个目的是提供包含上述核苷酸的重组表达载体。另外，本专利技术的另一个目的是提供包含上述肽或重组表达载体的凝血剂、抗炎剂、抗细菌或抗真菌剂。本专利技术的以上目的将通过以下特征实现：(1)来源于东方蜜蜂的赛卡品肽，其具有由SEQ.ID No.2限定的氨基酸序列。(2)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有纤溶酶抑制活性。(3)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有弹性蛋白酶抑制活性。(4)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有对抗选自枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K所组成的组中至少一种蛋白质的抑制活性。(5)多核苷酸，其具有由编码根据上述(1)的肽的SEQ ID No.1限定的碱基序列。(6)重组表达载体，其包含根据上述(5)的多核苷酸。(7)凝血剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的表达载体。(8)抗炎剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的表达载体。(9)抗细菌或抗真菌剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的
表达载体。本专利技术可以鉴别来源于东方蜜蜂的赛卡品肽和对其编码的基因序列，使得能够大量生产东方蜜蜂源性赛卡品肽。本专利技术的赛卡品肽可以表现出纤溶酶抑制活性、弹性蛋白酶抑制活性、抗细菌和抗真菌作用，从而用于广泛的应用，包括例如凝血剂、抗炎剂、抗细菌和抗真菌剂等。附图说明本专利技术的上述和其他目标、特征和其他优点将从以下结合附图的详细说明中更清楚地了解，所述附图中：图1是图示本专利技术的东方蜜蜂源性赛卡品肽和其他赛卡品肽之间同源性的图(下划线部分：信号肽位点，虚线框：成熟肽区域，和实心圆：形成保留的二硫键的半胱氨酸残基)；图2是图示重组蛋白的电泳结果的图，其中只有本专利技术的东方蜜蜂源性赛卡品肽之中的成熟肽位点被表达；图3是图示本专利技术重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)的纤溶酶抑制活性的图；图4是图示本专利技术重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)的弹性蛋白酶抑制活性的图；图5是图示本专利技术重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)对抗枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的抑制活性的图；和图6是Western印迹分析和共焦显微照片，图示了本专利技术的重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)对细菌和真菌的结合能力。具体实施方式在下文中，将更详细地描述本专利技术。本专利技术人已经如下所述分离了所述东方蜜蜂源性赛卡品肽(赛卡品：AcScp)氨基酸序列和编码上述赛卡品肽的多核苷酸。利用从东方蜜蜂昆虫体提取的poly(A)和mRNA制备cDNA文库，然后进行表达序列标签(EST)的分析。根据东方蜜蜂EST分析，克隆编码所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的基因的cDNA并由SEQ ID No.1限定。另外，从编码所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的cDNA翻译的氨基酸序列数据库分析结果由SEQ ID No.2限定。所述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因首先从东方蜜蜂分离，然而，其具体特征还没有报告。本专利技术鉴定了来源于东方蜜蜂的AcScp的序列，并且该基因在2015年5月15日在NCBI GenBank数据库中登记，登录号(accession No.)KR 732613(cDNA)。由于分离根据本专利技术的来源于东方蜜蜂的AcScp的cDNA和分析其碱基序列的结果，发现所得到的东方蜜蜂源性AcScp基因的cDNA具有SEQ ID No.1的碱基序列，所述碱基序列直至终止密码子的长度为348bp，其中由多核苷酸序列SEQ ID No.1编码的蛋白质由115个氨基酸组成，包括由24个氨基酸组成的信号肽位点和由25个氨基酸组成的成熟肽区域，并具有两个半胱氨酸结构。通过只表达所述成熟肽部分得到的重组蛋白质通过电泳具有约3.7kDa的分子量。由所述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因编码的氨基酸序列显示出与在NCBI GenBank数据库中登记的赛卡品肽(西方蜜蜂-3，佛罗里达弓背蚁等)的氨基酸序列的高度同源性(参见图1)。具有根据本专利技术的SEQ ID No.2的氨基酸序列的肽可以具有对抗纤溶酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K等的蛋白抑制活性。另外，本专利技术提供包括SEQ ID No.1的核苷酸的重组表达载体。在本公开中，术语“载体”是指DNA产物，其含有与适当的控制序列可操作性连接的特定基因的碱基序列，以便在合适的宿主内表达目的基因。在此，所述控制序列可以包括能够启动转移的启动子、控制所述转移的任何随机操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体连接位点的序列、以及控制转移和转录的终止的序列。在本公开中，“可操作性连接”的措辞是指编码目的蛋白的核酸序列与核酸表达控制序列功能性连接以执行一般功能。例如，启动子可以
与编码影响编码序列表达的蛋白质或RNA的核酸序列可操作性连接。与重组载体的可操作性连接可以利用相关领域中公知的遗传重组技术形成，而位点特异性DNA切割和连接利用相关领域中通常已知的任何酶等进行。本专利技术的载体可以包括，例如，启动子、起始密码子、终止密码子、表达控制元件例如聚腺苷酸化信号和增强子、分泌信号等，并可以根据其用途制备成多样化的类型。所述起始密码子和终止密码子应该对被施用遗传构建物的对象起作用，并在编本文档来自技高网...

【技术保护点】
来源于东方蜜蜂的赛卡品肽，其具有由SEQ.ID No.2限定的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2015.05.21 KR 10-2015-00712271.来源于东方蜜蜂的赛卡品肽，其具有由SEQ.ID No.2限定的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的赛卡品肽，其中所述肽具有纤溶酶抑制活性。3.根据权利要求1所述的赛卡品肽，其中所述肽具有弹性蛋白酶抑制活性。4.根据权利要求1所述的赛卡品肽，其中所述肽具有对抗选自枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炳来，李光植，金保娟，
申请(专利权)人：东亚大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR