核桃粕抗氧化肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及核桃粕抗氧化肽及其制备方法，本发明专利技术利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。本发明专利技术所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，本专利技术利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。本专利技术所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。【专利说明】
本专利技术涉及天然抗氧化肽
，具体涉及核桃柏抗氧化肽及其制备方法。
技术介绍
自从英国Harman于1956年提出自由基理论以来,人们逐步认识到人体许多慢性疾病如免疫力下降、心血管疾病、神经组织退化紊乱、癌症及衰老都与体内氧化产生的自由基有关，因而抗氧化剂的研究越来越被人们所关注。传统使用的抗氧化剂多为化学合成抗氧化剂，如二叔丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基羟基茴香醚(BHA)，由于价廉且具有很强的抗氧化能力而被广泛使用，但是由于其对人体健康存在潜在的危害而被限制使用。因此，寻找和开发安全、无毒、高效的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。天然抗氧化肽是存在于动植物体中具有抗氧化活性的肽类，它具有清除自由基、螯合金属离子、猝灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，易被人体吸收，无毒副作用，营养和加工特性良好，因此在人类食品和药品中具有巨大的开发前景。目前也有很多学者采用酶解的技术从植物或者动物组织中制备得到活性很强的抗氧化肽。专利技术申请专利(申请号201010141974.3)公开了一系列的胶原蛋白抗氧化肽，具有如下之一的氨基酸序列:(I) Hyl-Cys ； (2) Gln-Gly-Ala-Arg ； (3) Leu-Gln-Gly-Met ； (4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp,该产品抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分，而且具有分子量小的特点，易被消化道直接吸收。专利技术申请专利(申请号200510009423.0)公开了通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等强度的强抗氧化能力的三种抗氧化肽，氨基酸序列为:(I)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu ； (2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln ； (3)Ser-Leu-Pro-1Ie-Leu-His-Glu-Trp。核桃，又名羌桃、胡桃，属胡桃 科胡桃属植物，是一种经济价值和营养价值都很高的珍贵果木。核桃与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。核桃蛋白中蕴涵许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解有可能释放出活性的肽段。核桃经过浸提出大部分油脂剩下的部分即为核桃柏，含有40%以上的蛋白质。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，含有18种氨基酸，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理。但目前大部分优质核桃柏直接当做饲料和肥料处理掉，浪费了许多优质蛋白质资源。通过酶解得到核桃多肽可以作为食品添加剂或营养多肽，以提高核桃蛋白的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种更安全、高效利用原料，且抗氧化活性很强的抗氧化肽的制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列有来自D2的Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281)，Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met(279.1336)和 D3 的 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys(192.1384), Asn-Trp(318.3007), Cys-Arg(288.2900), Ser-Gln-Lys(362.3272), Cys-His-Cys(362.3265)。本专利技术提供一种利用商业食品级蛋白酶，酶解核桃柏蛋白，并对酶解物进行分离纯化，得到十四种抗氧化肽。核桃柏抗氧化肽的制备方法，具体步骤如下:(I)核桃柏蛋白酶解物的制备:将核桃柏与水按质量比1:8~1:10混合，加入占核桃柏蛋白质量1%_2%的胰酶，在50-55°C酶解18-22h ;沸水中10_30min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃柏蛋白酶解液，冻干得到核桃柏蛋白多肽粉末；(2)抗氧化肽的分离纯化:将核桃柏蛋白酶解液冻干后，用01.6x100 cm的Sephadex G-15凝胶柱进行分离纯化,用去离子水以0.5~2.0ml/min的流速进行洗脱,检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，冷冻干燥得粉末D ；(3)将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，得到所述抗氧化肽；其中纯化条件为:色谱柱为XBr i dgeTMpre C18tt (5 μ m, 10X150mm;WaterS，USA)，流动相为A相-B相，所述A相为已腈，所述B相为0.l%-0.2%V/V 二氟乙酸水溶液，洗脱程序为:在0_4min内米用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95% ;在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85% ;在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12_30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为1.5-4mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个峰。将得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法测定肽的分子量及氨基酸序列。上述方法得到的抗氧化肽，所述活性组分D2具有Tyr-Ser (269.1126)，Tyr-Ser-Val-His(505.2281)，Tyr-Lys(310.1367)，Tyr-Thr(283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性组分 D3 具有 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025)，Ala-His(255.1593)，Ala-Cys(192.1384)，Asn-Trp(318.3007)，Cys-Arg (288.2900)，Ser-Gln-Lys (362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序列。在本专利技术中，米用ORAC(Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收能力)法来测定抗氧化肽的活性。该方法现已经成为美国农业部、美国卫生院、FDA评价食品抗氧化能力的重要标准。欧洲、日本等国家的食品、功能食品行业也普遍采用ORAC作为抗氧化能力的重要评价标准，是目前评价体外抗氧化能力最权威性的方法。基于ORAC反应在75mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)环境中进行，FL (荧光素钠盐)、AAPH (自由基产生剂)、标准抗氧化物质Trolox (水溶性维生素E类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为:在96孔板各微孔中分别加入待测样品20 μ 1，FL (终浓度为70nmol.L—1) 120 本文档来自技高网...

【技术保护点】
核桃粕抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：（1）核桃粕蛋白酶解物的制备：将核桃粕与水按质量比1:8～1:10混合，加入占核桃粕蛋白质量1%?2%的胰酶，在50?55?℃酶解18?22h；沸水中10?30?min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃粕蛋白酶解液,冻干得到核桃粕蛋白多肽粉末；（2）抗氧化肽的分离纯化：将核桃粕蛋白酶解液冻干后，用?1.6×100?cm?的Sephadex?G?15凝胶柱进行分离纯化，用去离子水以0.5～2.0?ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，冷冻干燥得粉末D；（3）将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，得到所述抗氧化肽；其中纯化条件为：色谱柱为XBridgeTM?pre?C18?柱(5?μm,?10?×?150?mm;?Waters,?USA)，流动相为A相?B相，所述A相为已腈，所述B相为0.1%?0.2%V/V三氟乙酸水溶液，洗脱程序为：在0?4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95%；在4?8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%；在8?12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12?30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为1.5?4mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个峰。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任娇艳，陈卉平，赵谋明，崔春，顾敏，蔡孟森，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：