一种小球藻抗氧化肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小球藻抗氧化肽的制备方法，以小球藻为原料，利用稀碱溶胀结合超声波工艺，对小球藻进行破壁处理获得可溶性蛋白质，小球藻蛋白用生物酶法进行水解，获得了抗氧化效果明显的小球藻抗氧化肽。本发明专利技术还公开了超低温处理、高压处理结合稀碱溶胀与超声波的处理工艺能提高水溶性蛋白质的得率，并且能进一步提高水解产物的抗氧化能力。本发明专利技术所得产品纯度高，抗氧化活性强。

【技术实现步骤摘要】
一种小球藻抗氧化肽的制备方法(一)
本专利技术涉及一种小球藻抗氧化肽的制备方法。(二)
技术介绍
自由基(Freeradicals)是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，由于其单电子的结构而表现出极其活泼的不稳定性，在生物体内主要包括超氧阴离子自由基(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、氧有机自由基(RO·)、有机过氧基(ROO·)、活性氧(ROS)、脂自由基(L·)和脂过氧基(LOO·)等。具有活性的自由基对一般的组织和生物膜都可产生不同程度的危害，因此自由基在生理、病理上的作用机理受到了广泛的关注，越来越多的学者投入相关的研究中。存在在人体内的氧自由基主要有两个方面的来源：外源性和内源性。“外源性自由基”是由紫外线或环境污染等外来因素引发；“内源性自基”一般是在生物新陈代谢的过程中，由人体内生化反应所产生。在机体正常代谢活动中，机体内抗氧化系统能将自由基的产生和清除维持在平衡状态。但外界的逆境环境或机体的衰老导致的抗氧化系统功能的下降会引发自由基的过量积累，过量的自由基会给机体造成不可逆转的氧化损伤，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老，形成恶性循环，引发包括心脏病、老年痴呆症、癌症、糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化在内的多种疾病。近年来,随着海洋资源的不断开发，海洋生物资源也大量地被列入研究行列中，海洋资源成为了新能源开发不可或缺的一部分。人们在对海洋生物的研究中，不断地从海洋生物中发现一些具有抗氧化活性的化合物，多糖、蛋白质、多肽乃至氨基酸都出现不同程度的抗氧化活性。海洋生物抗氧化物质可通过各种途径清除内源性和外源性自由基,具有抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作用低等特点。从海洋生物中寻找新的天然抗氧化活性物质、新的抗衰老药物已成为海洋药物研究的重要目标之一。地球上有3万多种不同的微藻，分布在淡水和海洋里，在各种土壤(包括酷暑和寒冷的荒芜环境)里也都有微藻存在。人类最初对微藻的利用是简单的动物饲料，后来开始出现部分微藻食品或者保健品，但是这些产品对微藻这种天然高效能源的利用率还有待提高。近几十年来，人们逐渐注重微藻生物活性物质的研究和开发。微藻所含有的活性成分具有重要经济价值，在医药、保健品、饲料、化工和环保等方面有广泛的应用，微藻中含有大量蛋白质，优质的人工微藻蛋白质含量普遍可以达到50％以上。微藻蛋白质提取物具有一定的抗氧化性，这些提取物在一定条件下水解后的产物具有更高效的抗氧化特性。从海洋藻类中提取天然抗氧化药物的研究有待进行。来源于天然蛋白质的水解抗氧化肽近年来逐渐成为研究热点。Suetsuna等从酪蛋白的胃蛋白酶酶解物中发现了具有自由基清除活性的肽。等在文章中指出，WIP酶解物在分子量小于6kD的时候具有较明显的抗氧化活性。Hernández-Ledesma等在做β-乳球蛋白和α-乳清蛋白水解产物的抗氧化性的过程中，对商业蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和CorlosePP)进行了详细的对比，在结论中表示，CorlosePP蛋白酶的水解产物具有较高的抗氧化活性，其抗氧化组分分子量小于3kD。ZengWeiCai等使用凝胶过滤层系、高效液相色谱等分离手段在牛毛中提取了一种大小为18.7kDa的多肽，具有显著的抗氧化能力，能有效防止油脂的氧化。Seung-JaeLee等利用反相高效液相色谱在鸭子皮肤中提取了一种大小为941Da的抗氧化肽，具有保护肝脏免受酒精损害的活性，该多肽在细胞环境中能够参与细胞凋亡的相关途径的调节。ZhangYufeng[28]等在罗非鱼鱼皮中提取出两种抗氧化肽，氨基酸序列分别为Glu-Gly-Leu(317Da)和Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr(645Da)，并指出multifectneutral和properaseE两种酶可以作为高抗氧化性肽制备用酶。自然界中微藻有3万多种，但目前被人类利用开发的只有十余种。小球藻(ChlorellapyrenoidosaFACHB5)是一类普生性单细胞藻类。小球藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，具有很高的应用价值。以小球藻酶水解抑菌肽作为天然防腐剂用于食品中来达到抑菌的目的，不但在食品加工业将有广阔的应用前景，并且在环境保护等方面做出了一定贡献。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种以小球藻为原料制备抗氧化肽的方法。本专利技术采用的技术方案是：一种小球藻抗氧化肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，在不断搅拌下向小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％(优选1％)，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0(通常加稀盐酸调pH值)，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；(2)小球藻蛋白加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL浓度的底物溶液，按酶与底物的质量比([E]/[S])＝1:25分别加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下，进行酶解反应，反应0.5～5h，然后将酶解液升温至90～95℃反应15～30min，结束酶解反应，所得反应液浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得棕黄色的小球藻抗氧化肽。进一步，本专利技术所述步骤(1)中，所述离心分离优选在2000～4000rpm下离心10～20分钟。所述步骤(1)中，所述超声破壁处理一般在20～30KHz的超声条件下进行。所述步骤(2)中，复合风味蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；碱性蛋白酶的反应条件为pH值8.0，反应温度55℃；复合蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；中性蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度45℃。所述反应条件中pH值可通过配制相应pH值的PBS缓冲液来进行调节。所述步骤(2)中，优选加入复合风味蛋白酶进行酶解反应，反应条件为pH值6.0，反应温度50℃，酶解反应的时间优选5小时。进一步，本专利技术所述步骤(1)中，优选在碱性提取前经超低温或高压均质处理，具体的，所述步骤(1)优选按以下之一的步骤操作：(1-a)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70℃下冷冻12h，再于30℃下解冻至4℃，在不断搅拌下向解冻后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％(优选1％)，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0(通常加稀盐酸调pH值)，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；(1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小球藻抗氧化肽的制备方法，其特征再于所述方法包括以下步骤：(1)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，在不断搅拌下向小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；(2)小球藻蛋白加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL浓度的底物水溶液，按酶与底物的质量比1:25加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下，进行酶解反应，反应0.5～5h，然后将酶解液升温至90～95℃反应15～30min，结束酶解反应，所得反应液浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得小球藻抗氧化肽。

【技术特征摘要】
1.一种小球藻抗氧化肽的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70℃下冷冻12h，再于30℃下解冻至4℃，在不断搅拌下向解冻后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；(2)小球藻蛋白加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL浓度的底物水溶液，按酶与底物的质量比1:25加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下，进行酶解反应，反应0.5～5h，然后将酶解液升温至90～95℃反应15～30min，结束酶解反应，所得反应液浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得小球藻抗氧化肽。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，复合风味蛋白酶的反应条...

【专利技术属性】
技术研发人员：张拥军，王爽，张高帆，苏东洋，朱丽云，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33