一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗VEGF和EGFR的单链双特异抗体，所述单链抗体由抗VEGF的抗体轻链和抗EGFR的抗体重链通过连接肽融合而成，其具有能够分别识别VEGF和EGFR的两组独特的CDR区序列，对VEGF和EGFR具有高度特异的识别能力，且具有优异的肿瘤结合效果，对不同类型的肿瘤细胞系均有特异性结合。本发明专利技术还公开了偶联了指示剂的所述抗体在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。当所述成像剂应用在肿瘤动物模型上，标记了近红外荧光和核磁显像剂的该单链抗体可以清楚地显示出小鼠肿瘤的大小和位置，具有极高的体内成像能力。

A single chain double specific antibody against VEGF and EGFR and its application

The present invention discloses a single chain double specific antibody against VEGF and EGFR. The single chain antibody is fused by the anti VEGF antibody light chain and the anti EGFR antibody heavy chain through the connective peptide, which has two unique CDR region sequences capable of identifying VEGF and EGFR respectively, and has a highly specific recognition ability to VEGF and EGFR, and is excellent. The tumor binding effect is specific for different types of tumor cell lines. The invention also discloses the application of the antibody coupled with the indicator in the preparation of in vitro tumor diagnostic reagents and in vivo biological imaging agents. When the imaging agent is used in the tumor animal model, the single chain antibody labeled with the near infrared fluorescence and NMR can clearly show the size and location of the tumor in mice, and has a very high imaging ability in the body.

【技术实现步骤摘要】
一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体及其应用
本专利技术涉及一种抗体，更具体地，本专利技术涉及一种单链抗体。
技术介绍
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。而我们发现血管表皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。然而，现有技术中的抗体也因为特异性不高导致肿瘤结合效果欠佳，靶点单一以至于存在漏检风险，偶联剂标记单一造成检测成本增高，以及抗体与指示剂的偶联适应度不高限制成像效果等问题而限制了这一诊断手段的进一步应用。
技术实现思路
基于现有肿瘤诊断存在的技术问题，本专利技术的目的是研发出一种具有特异性识别能力的双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体，并同时偶联顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料进而提供一种既能作为体内核磁成像剂，又能作为体内荧光成像剂的双特异抗体。基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体，所述抗体的轻链来源于抗血管表皮生长因子(VEGF)的抗体，其CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链来源于抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体，其CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。在一个又为优选的技术方案中，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。在一个最为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区位于所述抗体的氨基端。其次，本专利技术提供了一种生物大分子偶联物，所述偶联物含有上述任一所述抗体。在一个优选的技术方案中，在所述偶联物中，FITC、近红外荧光蛋白和/或顺磁性阳性造影剂与所述抗体偶联。在一个更为优选的技术方案中，所述近红外荧光蛋白与所述顺磁性阳性造影剂同时与所述抗体偶联，所述近红外荧光蛋白为irdye800，所述顺磁性阳性造影剂为DOTA-gd。再次，本专利技术提供了上述偶联物在制备肿瘤体内成像诊断制剂中的应用。最后，本专利技术提供了上述偶联物在制备免疫荧光诊断试剂中的应用，所述FITC与所述抗体偶联。本专利技术选取具有确定性抗肿瘤作用的靶点血管表皮生长因子和表皮生长因子入手，利用全人源的噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗VEGF和EGFR的ScFv，选取具有单独的特异性抗原结合活性的抗VEGF的轻链可变区(VL)和抗EGFR的重链可变区(VH)，利用分子生物学方法将两者在基因水平上组成一个双特异的ScFv单链抗体。本专利技术的双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体具有优异的亲和力，亲和力常数分别为5.18×10-9M和4.26×10-9M。而大多数自身抗体的亲和力常数小于10-5--8M，本专利技术的双特异的单链抗体用于体内诊断显像时可以不仅竞争自身抗体与EGFR表面抗原结合，也可以竞争自身抗体与VEGF结合，大大提高了抗体诊断肿瘤的灵敏性。在具有高特异的抗原结合能力的序列基础上，本专利技术将该单链双特异性抗体偶联顺磁性阳性造影剂和/或近红外荧光，作为体内核磁和/或荧光显像剂，并得到了很好的应用。本专利技术的独特构思在于利用两个针对不同靶点的VL和VH组成一个双特异的ScFv单链抗体，在分子量不增加的前提下，具有同时识别两种靶点。另一独特构思在于在这个单链抗体上同时偶联两种显像剂，可同时利用核磁或激光成像，不仅拓宽了这种单链抗体的体内应用方式。而且利用特异性识别肿瘤靶点的单链抗体进行肿瘤体内成像也降低了假阳性率，提高了确诊率。仅仅通过核磁就能达到确诊，不用患者再进行放射性核素成像，减少了患者的核暴露伤害。最后该双特异的单链抗体也可以应用到肿瘤切除手术中，为医生提供手术导航，达到彻底清除肿瘤组织和转移病灶的效果。由于本专利技术选用的是抗体小分子片段，该单链抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。附图说明图1.VH和VLPCR产物鉴定图；图2.载体图谱和重组载体鉴定图；图3.筛选出的VEGFVL、EGFRVH、VEGF-EGFRScFv与VEGF-165、EGFR蛋白的结合试验柱状比较图；图4.纯化后的VEGFVL、EGFRVH以及VEGF-EGFRScFv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；图5.FITC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。5.根据权利要求4所述的抗体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢珞琨，满来，李峥，许春萍，
申请(专利权)人：北京格根生物科技有限公司，亦康北京医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11