一种抗IL‑13Rα2和CD3双特异抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种抗IL‑13Rα2和抗CD3的双特异抗体及其应用，本发明专利技术双特异性抗体能够特异性结合肿瘤细胞表面抗原表皮生长因子受体IL‑13Rα2和免疫细胞表面抗原分化簇3即CD3分子；其中抗CD3抗体的单链抗体ScFv位于抗IL‑13Rα2抗体恒定区的C末端。本发明专利技术还提供了该双特异性抗体的制备方法及其临床用途。本发明专利技术双特异性抗体具有较高的亲和力，用于治疗IL‑13Rα2高表达或非正常表达所引起的肿瘤疾病，以及其他IL‑13Rα2过表达引起的疾病。

An anti IL 13R alpha 2 and CD3 bispecific antibody and its application

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a 13R alpha 2 anti IL and anti CD3 bispecific antibody and its application, the invention can bispecific antibody specific binding to tumor cell surface antigen of epidermal growth factor receptor alpha 2 and 13R IL immune cell surface antigen cluster of differentiation 3 CD3 C at the end of the molecule; ScFv single chain antibody of anti CD3 antibody in IL anti 13R alpha 2 antibody constant region. The invention also provides a method for preparing the bispecific antibody and its clinical application. Bispecific antibody of the invention has a high affinity for the treatment of IL 13R alpha 2 high expression or abnormal expression of tumor caused by the disease, as well as other IL 13R alpha 2 expression caused by disease.

【技术实现步骤摘要】
一种抗IL-13Rα2和CD3双特异抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种针对IL-13Rα2和CD3的双特异性抗体的构建和制备方法，以及该抗体在疾病中的应用。
技术介绍
单克隆抗体广泛应用于癌症、炎症和其它疾病的治疗，由于这些抗体所针对的都是单一的靶标，很多患者不能充分响应单一的疗法，时常出现抗药性。双特异性抗体能够同时识别两个不同的抗原或抗原表位，可以作为一种媒介重新定向免疫效应细胞，如自然杀伤细胞和T细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤功能。此外，双特异性抗体还可以定位于同一个细胞的两个不同的抗原，导致细胞信号的改变，包括癌症扩散信号或炎症信号。经过长时间的研究和发展，出现了多种形式的双特异性抗体，如双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体和多价双特异性抗体等。这些双特异性抗体基本上分为两大类:含有Fc的和不含有Fc的。前者具有较好的溶解性、稳定性和半衰期，而Fc介导的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖性细胞溶解效应(CDC)可以带来一些治疗所需的附加效应。相比之下，缺乏Fc的双特异性抗体完全依赖其抗原结合能力发挥其治疗作用；另外Fc蛋白可以延长药物蛋白（或多肽)在体内的半衰期，从而延长活性分子在体内的作用时间。胶质瘤是颅内最常见颅内原发肿瘤，恶性程度高，治疗棘手，具有高致残率、高复发率、高死亡率特点。目前，胶质瘤缺乏根治手段，手术切除仍是治疗胶质母细胞瘤的首选方案，但由于胶质母细胞瘤呈浸润性生长，常没有边界，手术仍无法彻底切除，复发率100%。因此，胶质瘤的治疗常采用手术+放疗+化疗，以及生物治疗的综合治疗方案。尽管如此，高级别胶质瘤患者的平均生存期也仅为14.6月，患者的五年生存率小于5%；而不经过治疗的患者的平均生存期只有4.5个月，只有三分之一的患者生存期超过1年，五年生存率几乎为0，在所有癌症中排首位。因此，找寻并研发具有临床效果的药物成为胶质瘤的重要研究方向，也是急不可待的任务，目前研究的方向包括各种疫苗、抗体和新型T细胞治疗等。IL-13Rα2最先是由Caput等人在人Caki-1肾癌细胞系中发现的，其编码基因主要定位于Xq24，编码由380个氨基酸残基组成的跨膜受体蛋白，包括341个氨基酸残基组成的胞外区、一个仅仅只有17个氨基酸残基的胞内区和22个氨基酸残基组成的跨膜区。现有的研究证实在IL-13Rα2脑胶质瘤中特异性高表达，且胶质瘤的级别越高，其表达的强度越大，而在正常脑组织中不表达或极低表达，因此可用做胶质瘤靶向治疗级佳的靶点。免疫细胞表面抗原分化簇3(CD3):CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志，由6条肽链组成，以非共价键与T细胞抗原受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，不仅参与TCR-CD3复合体的胞浆内组装，而且通过各多肽链胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)传递抗原刺激信号。CD3分子的主要功能为：稳定TCR结构，传递T细胞活化信号，当TCR特异性识别并结合抗原后，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，作为诱导T细胞活化的第一信号，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。双特异性抗体具有良好的效果和前景，能够同时结合肿瘤细胞和免疫细胞上的特异性抗原-抗免疫活性细胞CD16或CD3的部分，具有激活NK细胞或T细胞作用，而抗肿瘤的特异性抗原部分可以结合肿瘤细胞，将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，提高局部NK细胞或T细胞浓度，从而使免疫效应细胞对肿瘤细胞起到特异性杀伤作用。现有技术中，还没有成功上市的IL-13Rα2和CD3双特异性抗体药物产品，该项技术有待研究。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术中提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体在抗IL-13Rα2的C-端增加了抗CD3的ScFv序列，这种双特异抗体保留了抗IL-13Rα2抗体完整分子结构，同时增加了结合CD3抗原的能力，这样既保持了原有IL-13Rα2抗体在体内生物学活性，同时通过特异性识别两种不同的抗原，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本专利技术提供了抗IL-13Rα2和抗CD3双特异抗体及其应用。包含(a)完整的单克隆抗体，（b)单链抗体ScFv和（C)连接子;所述(a)与IL-13Rα2抗原特异性结合并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成;所述(b)与免疫细胞抗原CD3特异性结合，所述(b)为两条单链抗体ScFv;所述(b)为两条单链抗体ScFv;所述(b)的两条单链抗体ScFv分别通过所述(c)连接子linker与所述(a)的两条重链的C末端连接。其中，所述双特异抗体中所述(c)连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-4的自然数n优选3。所述双特异性抗体(a)完整的单克隆抗体是由两条轻链和两条重链组成，每条重链和轻链之间通过二硫键连接，两条重链之间通过铰链区的二硫键连接。所述重链和轻链的可变区特异性结合肿瘤细胞表面IL-13Rα2抗原。其中，所述(a)完整的单克隆抗体的重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种，优选IgG2。所述(a)完整的单克隆抗体的重链可变区中重链CDR1包含SEQIDNO1、重链CDR2包含SEQIDNO2重链CDR3包含SEQIDNO3；所述(a)完整的单克隆抗体的轻链可变区CDR1包含SEQIDNO4、重链CDR2包含SEQIDNO5重链CDR3包含SEQIDNO6。所述(b)单链抗体ScFv的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO8,所述(b)单链抗体ScFv的轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO9。所述(b)两条单链抗体ScFv的氨基酸序列均为SEQIDNO7。每个(b)单链抗体ScFv是由重链可变区、（c)连接子linker和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区特异性结合免疫细胞表面CD3抗原；所述（c)连接子linker的氨基酸序列为(GGGGS)n，n为1-4的自然数，优选为(GGGGS)3。其中，构建双特异抗体的表达载体，其中所述双特异抗体可以构建到一个载体中，或者分别构建到两个不同的载体上。通过基因工程方法将构建好的载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如293T细胞、NSO细胞或其他哺乳细胞，优选为293T细胞。通过常规的免疫球蛋白方法，包含蛋白质A亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法获得所述双特异性抗体。所述双特异性抗体用于IL-13Rα2高表达或非正常表达的胶质瘤的治疗及其他IL-13Rα2过表达引起疾病的治疗。其中，所述完整的单克隆抗体为全长抗体。本专利技术的双特异性抗体是采用四价抗体的形式，这种形式的四价抗体完整的保留了结合肿瘤抗原的抗体序列，具有较高的亲和力。同时四价双特异抗体可以更好的连接肿瘤细胞和效应细胞，从而更有利于发挥双特异抗体的生物学功能。相对于现在常用的BITE双特异抗体形式，本专利技术中的分子还包括了Fc片段；Fc片段的存在可以延长药物分子在体内的半衰期，从而能够使药物分子更好的发挥作用，降低病人用药频率，减轻病人的痛苦。本专利技术用于高表达或非正常表达I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性抗体，其特征在于，包含(a)完整的单克隆抗体、（b)单链抗体ScFv和 (c)连接子;所述(a)与IL‑13Rα2抗原特异性结合并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成;所 述(b)与免疫细胞抗原CD3特异性结合，所述(b)为两条单链抗体ScFv;所述(b)的两条单链 抗体ScFv分别通过所述(c)连接子linker与所述(a)的两条重链的C末端连接。

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，包含(a)完整的单克隆抗体、（b)单链抗体ScFv和(c)连接子;所述(a)与IL-13Rα2抗原特异性结合并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成;所述(b)与免疫细胞抗原CD3特异性结合，所述(b)为两条单链抗体ScFv;所述(b)的两条单链抗体ScFv分别通过所述(c)连接子linker与所述(a)的两条重链的C末端连接。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述(c)连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中X包含GIy或Ser，所述X优选Ser;n为1-4的自然数，n优选3。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述(a)完整的单克隆抗体的重链CDR氨基酸序列为SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3,所述(a)完整的单克隆抗体的轻链CDR氨基酸序列为SEQIDNO4、SEQIDNO5或SEQIDNO6。...

【专利技术属性】
技术研发人员：周良学，王跃龙，邓佼娇，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51