用于双功能免疫复合物的原位形成的方法技术

描述了一种直接在样品中的靶标实体的表面上制备四聚体抗体复合物的改进方法。具体来说，这种方法涉及使用对第一靶标实体和第二靶标实体具有特异性的抗体，在样品中将所述第一靶标实体与样品中的所述第二靶标实体连接。

A method for in situ formation of double functional immune complex

An improved method for preparing four polymer antibody complexes directly on the surface of the target entity in the sample is described. Specifically, the method involves the use of antibodies that are specific to the first target entity and the second target entity. In the sample, the first target entity is connected to the second target entity in the sample.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于双功能免疫复合物的原位形成的方法相关申请本专利合作条约申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2015年6月10日提交的美国临时申请号62/173,600的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。领域本公开涉及用于直接在样品中的靶标实体的表面上制备四聚体抗体复合物而不是在将双功能免疫复合物加入到样品中之前制备所述双功能免疫复合物的方法和试剂盒。背景生物靶标(诸如分子、DNA、蛋白质或细胞)的特定标记是生命科学和医学领域中许多不同应用所需的。标记提供了使用标记的新功能或物理特性(荧光、磁性、密度、酶活性、放射性等)从复杂生物样品内检测或操纵靶标的灵敏方式。例如，任何生物活性药物对生物靶标的抗体介导靶向可以增加药物的效能和功效，同时减少对周围细胞和组织的毒性。抗体和重组蛋白的使用已用来特异性标记多种应用的生物靶标。这些方法中的大多数是出于表征、表型或分离的目的来鉴定靶标实体。抗体用于分离生物实体的用途被认为是免疫亲和纯化。在许多应用中，需要富集或替代地耗尽生物样品中的某些靶标实体群体。例如，从外周血、骨髓、脾脏、胸腺和胎肝分离特定的细胞类型是血液学、免疫学和肿瘤学领域的研究以及某些恶性肿瘤和免疫病症的诊断和疗法的关键。从这些异质样品中分离特定的细胞类型是这些领域的研究，某些恶性肿瘤和免疫/造血病症的诊断和疗法的关键。造血细胞和免疫细胞已经基于物理特征(诸如密度)并基于对杀死循环细胞的某些药剂的敏感性来分离。针对细胞表面抗原的单克隆抗体的出现极大地扩展了区分和分离不同细胞类型的潜能。存在两种基本概念方法以使用单克隆抗体从血液和相关细胞混悬液中分离细胞群体。它们的不同之处在于用抗体区别/标记的是所需细胞还是不需要的细胞。在阳性选择技术中，用抗体标记所需细胞并且将其从剩余的未标记/不期望的细胞中去除。在阴性选择中，标记并去除不期望的细胞。抗体/补体处理和免疫毒素的使用是阴性选择技术，但是FACS分选和大多数分批免疫吸附技术可以适用于阳性选择和阴性选择。四聚体抗体复合物(TAC)已广泛用于开发来自各种组织类型的众多免疫亲和细胞分离、阳性选择和阴性选择方法。TAC是第一动物物种的两种抗体(例如，小鼠抗体)的免疫复合物，所述抗体已经与第二动物物种的针对第一动物物种的抗体的Fc片段的两种单克隆抗体(例如，大鼠单克隆抗体)缀合以形成环状四聚体。在PeterM.Lansdorp的美国专利号4,868,109中已描述了制备TAC的过程。可通过将能够与磁性颗粒表面上的至少一种抗原结合的第一单克隆抗体和与靶标实体结合的第二单克隆抗体混合来制备TAC。第一单克隆抗体和第二单克隆抗体来自第一动物物种。第一抗体和第二抗体与约等摩尔量的针对第一动物物种的抗体的Fc片段的第二动物物种的单克隆抗体反应。第一抗体和第二抗体还可与约等摩尔量的针对第一动物物种的抗体的Fc片段的第二动物物种的单克隆抗体的F(ab‘)2片段反应。这导致形成单特异性和双功能TAC的混合物，后者是含有第一动物物种的两种不同抗体的TAC。双功能TAC对于它们将主要实体(诸如由给定细胞表达的抗原)交联至次要实体(诸如磁性颗粒)的能力是所需的。美国专利申请号US2006/0024824A1描述了一种用于在不需要从磁场梯度去除容器的情况下从包含在所述容器中的样品中的非靶标实体分离靶标实体的方法，并且示出了在磁性标记之后如何将TAC与EasySepTM技术一起用于分离细胞的实例。另一个潜在的次要靶标可能是红细胞，导致免疫玫瑰花结(immunorosette)的形成。美国专利号US6,448,075B1描述了一种使用免疫玫瑰花结分离细胞的方法，其涉及使样品与至少一种与有待分离的有核细胞上的抗原结合的抗体接触，所述抗原直接或间接地与结合红血球(即红细胞)的至少一种抗体连接。这导致有核细胞和红血球的免疫玫瑰花结的形成，然后可以从样品中去除所述免疫玫瑰花结。此方法用于例如RosetteSepTM阴性选择方案，其中所需细胞不形成免疫玫瑰花结，并且因此在免疫玫瑰花结被去除时仍然在样品中。对在细胞表面上表达的给定抗原具有特异性的单特异性TAC的存在可能潜在地减少功能性双功能TAC的可用表位以结合细胞并将细胞交联到次要实体。由于这个原因，反应产物中双功能复合物与两种单特异性复合物之间的比例可以通过改变所用第一动物物种的抗体的摩尔比而受到影响。例如，抗体比率可有所偏差以对于第二靶标实体更具特异性，使得虽然形成了更少的双功能TAC和更少的针对主要靶标实体的单特异性TAC，但是针对次要靶标实体的单特异性TAC的比例增加。制备TAC的当前现有技术方法是将抗体混合在水性缓冲液中。TAC一旦形成，就与主要靶标实体混合，并且随后与次要靶标实体混合。这导致双功能TAC首先结合主要靶标实体，并且然后交联到次要靶标实体。这种方法已被充分用于多种应用，诸如EasySepTM和RosetteSepTM技术。概述本专利技术涉及一种用于直接在水性样品中的靶标实体的表面上制备双功能四聚体抗体复合物(TAC)而不是在将双功能TAC加入到所述样品中之前制备所述双功能TAC的意料不到的且改进的方法。这种新方法是意料不到的，因为当前现有技术方法只是描述了在将TAC加入到靶标实体之前单独地形成TAC。这种新方法为现有技术方法提供了几个优点，因为(a)它提供了选择性分离具有高靶标抗原表达的靶标实体的能力，和(b)储存的单个抗体比TAC更稳定，并且因此可以在低温或冻干下较长期储存。制备TAC复合物的当前现有技术方法是将抗体在水性缓冲液中混合。为了优先形成双功能TAC复合物，加入摩尔比1:1:2的分别针对第一靶标实体、第二靶标实体和交联抗体的抗体。TAC的预测结果是25％主要<>主要:50％主要<>次要:25％次要<>次要。TAC复合物一旦形成，就用来标记第一靶标实体。使用这种方法，标记的靶标实体随后与次要靶标实体混合，从而允许与第一靶标实体结合的双功能TAC结合其第二靶标实体。本文所述的改进的方法不仅是意料不到的，而且还提供了性能改进。抗体结合动力学将表明大部分抗体复合物将在溶液中形成，并且在主要靶实体上形成双功能TAC复合物将受到限制。所发现的是使用这种方法以更高纯度分离了细胞。这种方法为现有技术方法提供了几个优点，因为它可以选择性分离具有高靶标抗原表达的靶标实体，并且其次单个抗体由于聚集而比免疫复合物更稳定并且因此可较长期储存。在一个实施方案中，公开了一种用于将样品中的第一靶标实体与第二靶标实体连接的方法，所述方法包括：(a)使第一靶标实体与对第一靶标实体具有特异性的第一抗体接触，其中第一抗体结合样品中的第一靶标实体；(b)将结合第二靶标实体的第二抗体加入到样品中；(c)将对第一抗体和第二抗体具有特异性的第三抗体加入到样品中，其中第三抗体结合所述第一抗体和第二抗体，从而形成四聚体抗体复合物；(d)加入第二靶标实体，其中第二抗体结合第二靶标实体，从而通过四聚体抗体复合物连接第一靶标实体和第二靶标实体。第一靶标实体优选为希望从样品分离的生物材料，所述第一靶标实体诸如细胞、细菌、病毒、细胞器、蛋白质或核酸。在一个实施方案中，第一靶标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将样品中的第一靶标实体与第二靶标实体连接的方法，所述方法包括：(a)使所述第一靶标实体与对所述第一靶标实体具有特异性的第一抗体接触，其中所述第一抗体结合所述样品中的所述第一靶标实体；(b)将结合所述第二靶标实体的第二抗体加入到所述样品中；(c)将对所述第一抗体和第二抗体具有特异性的第三抗体加入到所述样品中，其中所述第三抗体结合所述第一抗体和第二抗体，从而形成四聚体抗体复合物；(d)加入所述第二靶标实体，其中所述第二抗体结合所述第二靶标实体，从而通过所述四聚体抗体复合物连接所述第一靶标实体和第二靶标实体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.10 US 62/173,6001.一种用于将样品中的第一靶标实体与第二靶标实体连接的方法，所述方法包括：(a)使所述第一靶标实体与对所述第一靶标实体具有特异性的第一抗体接触，其中所述第一抗体结合所述样品中的所述第一靶标实体；(b)将结合所述第二靶标实体的第二抗体加入到所述样品中；(c)将对所述第一抗体和第二抗体具有特异性的第三抗体加入到所述样品中，其中所述第三抗体结合所述第一抗体和第二抗体，从而形成四聚体抗体复合物；(d)加入所述第二靶标实体，其中所述第二抗体结合所述第二靶标实体，从而通过所述四聚体抗体复合物连接所述第一靶标实体和第二靶标实体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三抗体结合所述第一抗体和第二抗体的Fc部分。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一靶标实体选自由以下组成的组：细胞、细菌、病毒、细胞器、蛋白质和核酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一靶标实体为细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一抗体处于第一抗体组合物中，所述第一抗体组合物包含对所述靶标细胞上的一种或多种抗原具有特异性的抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一抗体组合物包含对选自由以下组成的组的一种或多种抗原的组合具有特异性的抗体：CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD25、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD43、CD45、CD56、CD61、CD66b、CD123、CD127、CD138、α/βTCR、γ/δTCR和HLA-DR。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述第一靶标实体为T细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述T细胞为CD25+CD4+CD3+细胞。9.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·I·柯卡吉，
申请(专利权)人：干细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA