一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法技术

本发明专利技术公开了一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤；本发明专利技术的方法具有成本低、操作简便等优点，并且针对性强、灵敏度更高，经验证可高2‑3数量级；采用间接法比现在市售产品的直接法竞争法更易防干扰，不易产生假阳性，同时不依赖特定仪器，若定性检测，只需肉眼观测膜上斑点即可；本发明专利技术更可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物毒素的检测方法，尤其涉及一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，属于化学生物检测

技术介绍
现有的生物毒素TTX检测方法主要有生物测定法、仪器分析法、传感器法和免疫测定法等，但没有一种方法是针对TTX产生菌进行检测的；目前市场上出现了TTX快速检测产品，如ELISA试剂盒、免疫层析试纸条，普遍存在检测灵敏度低、线性范围窄、易出现假阳性、价格高等问题。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提出一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，该检测方法更易防干扰，不易产生假阳性，可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。为达到上述目的，本专利技术提出了一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，具体为：步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。步骤四、封闭：将膜，用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；步骤五、洗涤，加一抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；步骤六、洗涤，加二抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；步骤七、斑点显色：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。在本专利技术的步骤一中，恒温培养的温度为26℃。在本专利技术的步骤三中，置振荡器设置时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤四中，用牛血清封闭的时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤六中，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育时间为,温度为37℃。采用上述方法后，本专利技术的具体优点如下：1、和其他检测方法比如荧光PCR、蛋白质芯片、仪器分析技术比较，具有成本低、操作简便等优点；2、与市场有售的ELISA检测试剂盒比较，原理虽然也是基于酶联免疫检测，但可以说是第二代升级版本，针对性强、灵敏度更高，经验证可高2-3数量级；采用间接法比现在市售产品的直接法竞争法更易防干扰，不易产生假阳性；3、不依赖特定仪器，若定性检测，只需肉眼观测膜上斑点即可；4、更可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。具体实施方式下面采用具体实施方式对本专利技术作进一步详细地说明。一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，具体为：步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。步骤四、封闭：将膜，用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；步骤五、洗涤，加一抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；步骤六、洗涤，加二抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；步骤七、斑点显色：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。在本专利技术的步骤一中，恒温培养的温度为26℃。在本专利技术的步骤三中，置振荡器设置时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤四中，用牛血清封闭的时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育时间为一小时，温度为37℃。在本专利技术的步骤六中，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育时间为,温度为37℃。总的来说，本品采用高度特异性的抗体抗原反应及间接非竞争结合的原理，菌落中可能含有的生物毒素TTX首先通过与菌体蛋白偶联到NC膜上，通过生物毒素TTX单克隆抗体和酶标的抗抗体结合从而使底物显色，而在膜上呈现肉眼看见的斑点。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，其特征在于，具体为：步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。步骤四、封闭：将膜，用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；步骤五、洗涤，加一抗：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；步骤六、洗涤，加二抗：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；步骤七、斑点显色：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。...

【技术特征摘要】
1.一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，其特征在于，具体为：步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。步骤四、封闭：将膜，用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；步骤五、洗涤，加一抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；步骤六、洗涤，加二抗：用PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳萍，任天天，张立虎，李凤，
申请(专利权)人：盐城卫生职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32