一种NG-2免疫组织化学抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种NG

【技术实现步骤摘要】
一种NG
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2免疫组织化学抗体


[0001]本专利技术涉及一种NG
‑
2免疫组织化学抗体，属于生物医药


技术介绍

[0002]免疫组织化学是利用抗原与抗体间特异性结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的技术。免疫组织化学技术具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等特点，有利于在病理学领域的深入研究，在现代病理诊断中起重要作用。
[0003]病理科日常工作使用的免疫组织化学抗体品种达数百种，对人类疾病的诊断和治疗发挥着重要的作用。随着人类对疾病认识的不断提高，病理科应用的抗体种类也逐渐增加。在近十年来，随着人类基因组计划完成和蛋白质谱计划的推进，越来越多的抗体的潜在价值待被发掘，并不断扩展和添加到病理科抗体应用的目录中。
[0004]免疫组织化学中所使用的抗体，又称为一抗(Primary Antibody)，根据其制备方式可分为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体因其特异性高广受免疫组化使用者的青睐，在病理科使用的抗体中占绝大多数。但是，长期以来，由于免疫组织化学抗体相关的生产技术大多由国外进口，免疫组织化学一抗、检测系统和自动化染色系统等试剂多来自于国外公司，因此，免疫组织化学抗体的临床应用价值也多是由国外的学者探索发现。
[0005]免疫组织化学抗体的应用价值包括多个方面：首先，免疫组织化学抗体能够辅助诊断和鉴别诊断，为病理诊断和鉴别诊断提供客观证据。对于感染性疾病，通过免疫组织化学技术识别特定的细菌、病毒等微生物，提高感染性疾病病理诊断的准确性。对于肿瘤性疾病，免疫组织化学也通过多种途径来提供客观的诊断依据辅助病理诊断工作：如肿瘤良恶性判断，肿瘤细胞来源/分化方向；帮助病理医生判断原发性还是转移性；鉴别诊断肿瘤类型；肿瘤分级；肿瘤微小转移灶的发现和确定等。其次，为疾病治疗提供客观的指导方案，即伴随诊断；分子靶向药物肿瘤靶标的测定；肿瘤化学性药物治疗反应的预测；肿瘤预后的判断等。正是由于免疫组织化学在临床上广谱的应用价值，因此，抗体的应用研究方兴未艾。
[0006]本专利技术涉及一种在组织和细胞上进行免疫组织/细胞化学染色的抗体，用于与NG
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2(神经胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白)相关的正常细胞和肿瘤细胞的显示，以达到组织、细胞分型以及肿瘤组织鉴别诊断的目的。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题之一是一种NG
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2免疫组织化学抗体如何制备以及如何应用的技术问题。
[0008]为达到解决上述问题的目的，本专利技术所采取的技术方案是提供一种NG
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2抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1：选择编码NG
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2的核苷酸序列片段，构建质粒，在原核细胞中表达，并进行NG
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2蛋白表达和制备；
[0010]步骤2：采用NG
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2蛋白抗原免疫小鼠，进行抗原性分析：抗原乳化、免疫Balb/c小鼠；对免疫小鼠采血，检测免疫效果并进行ELISA血清滴度分析，融合前加强免疫，骨髓瘤细胞株的复苏、驯化，进行融合前准备；
[0011]步骤3：进行96孔细胞培养板的细胞融合；对细胞融合率进行检测；对母克隆培养上清进行ELISA检测，挑选阳性母克隆并进行免疫组化筛选，挑选免疫组化特异性好的进行上清检测；
[0012]步骤4：选择两个阳性亚克隆进行腹水生产准备；提供2个阳性亚克隆细胞株并进行腹水生产和抗体纯化，获得NG
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2抗体。
[0013]本专利技术提供一种NG
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2免疫组织化学抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]本专利技术提供一种NG
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2免疫组织化学抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]本专利技术提供一种NG
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2免疫组织化学抗体在制备与NG
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2相关的正常细胞和肿瘤细胞鉴别诊断试剂盒中的应用，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]本专利技术提供一种NG
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2免疫组织化学抗体在制备鉴别食管鳞状细胞癌和食管基底样鳞状细胞癌的诊断试剂盒中的应用，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]本专利技术制备了一种NG
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2抗体，能够特异性识别基底细胞相关肿瘤，用于相关疾病的鉴别诊断，具有潜在的预后、预测和靶标的价值。
[0018]本专利技术提供了一种NG
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2抗体制备和鉴定方法：
[0019]步骤1：选择NG
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2片段，构建质粒，在原核细胞中表达，并进行蛋白表达和制备；
[0020]步骤2：免疫小鼠，进行抗原性分析；抗原乳化、免疫5只Balb/c小鼠；对免疫小鼠采血，检测免疫效果并进行ELISA血清滴度分析，融合前加强免疫，骨髓瘤细胞株的复苏、驯化，进行融合前准备。
[0021]步骤3：挑选免疫效果理想(效价能达到要求)的小鼠，进行96孔细胞培养板的细胞融合；对细胞融合率进行检测；对母克隆培养上清进行ELISA检测，挑选阳性母克隆并进行免疫组化筛选(将阳性母克隆进行系列有限稀释，对培养上清进行ELISA检测，挑选ELISA阳性亚克隆进行免疫组化筛选)，挑选免疫组化特异性最好的10个克隆上清检测。
[0022]步骤4：选择最好的两个阳性亚克隆进行腹水生产准备，提供2个阳性亚克隆细胞株并进行腹水生产和纯化，纯化抗体量为10mg/克隆。两个阳性亚克隆代号为：CSPG4
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6B8E5和CSPG4
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6E3E2；
[0023]步骤5：抽提CSPG4
‑
6B8E5杂交瘤细胞RNA，进行5
’
端RACE反转录，cDNA PCR获得抗体重链/轻链可变区基因，重链和轻链可变区基因克隆测序，生物信息学分析，测序结果如
下：
[0024]SEQ ID NO.5：
[0025]重链可变区基因序列(Heavy chain variable region sequence)
[0026]H
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NG
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2抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：选择编码NG
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2的核苷酸序列片段，构建质粒，在原核细胞中表达，并进行NG
‑
2蛋白表达和制备；步骤2：采用NG
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2蛋白抗原免疫小鼠，进行抗原性分析：抗原乳化、免疫Balb/c小鼠；对免疫小鼠采血，检测免疫效果并进行ELISA血清滴度分析，融合前加强免疫，骨髓瘤细胞株的复苏、驯化，进行融合前准备；步骤3：进行96孔细胞培养板的细胞融合；对细胞融合率进行检测；对母克隆培养上清进行ELISA检测，挑选阳性母克隆并进行免疫组化筛选，挑选免疫组化特异性好的进行上清检测；步骤4：选择两个阳性亚克隆进行腹水生产准备；提供2个阳性亚克隆细胞株并进行腹水生产和抗体纯化；获得NG
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2抗体。2.根据权利要求1所述的一种NG
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2抗体的制备方法获得的一种NG
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2免疫组织化学抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯英勇，蒋冬先，徐晨，宋琦，陈伶俐，罗荣奎，张磊，黄雯，王慧美，刘玉凤，黄洁，沈立承，徐磊，刘佳，宿杰阿克苏，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：