从生物学样品检测稀有细胞的方法和组合物技术

本发明专利技术提供用于分离和检测含有其它类型细胞的样品中稀有细胞的方法和组合物。具体地说，本发明专利技术包括可利用微制造滤器的压实步骤或细胞裂解步骤或基于密度的方法来除去某些类型的细胞，和固定方法以除去其它类型的细胞。本发明专利技术还包括富集稀有细胞后通过检测端粒酶活性或端粒酶核酸或端粒酶表达的存在或量来测定生物学样品中癌细胞数量或比例的方法。本发明专利技术还提供专门除去生物学样品中红细胞以及白细胞的有效而快速方法，从而能富集稀有靶细胞。靶细胞的存在或水平提供各种生理情形，例如癌症的有关信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术总体上涉及生物分离和细胞检测领域，特别是生物学样品加工以检测稀有细胞(rare cell)的领域，和出于以下目的的下游应用筛选高危人群、诊断疾病、预测疾病或治疗结果、监测疾病状态或对疗法的反应、优化治疗方案或开发新疗法。 恶性肿瘤的相关死亡率大多数是因为在远离原发性肿瘤的组织和器官中形成转移。早期检测转移是癌症患者存活可能性的极其重要的决定因素(Feldstein M，Zelen M，Inferring the natural time history of breast cancerimplications for tumor growth rate and early detection(推测乳腺癌的自然时间史肿瘤生长和早期检测的暗示).Breast Cancer Res Treat.1984；4(1)3-10；SenieRT，Lesser M，Kinne DW，Rosen PP，Method of tumor detection influencesdisease-free survival of women with breast carcinoma(肿瘤检测的方法影响乳腺癌妇女的无疾病存活)，Cancer.1994年3月15日；73(6)1666-72；Carlson JA，Slominski A，Linette GP，Mysliborski J，Hill J，Mihm MC Jr，Ross JS，Malignantmelanoma 2003predisposition，diagnosis，prognosis，and staging(恶性黑色素瘤2003诱因、诊断、预后和分级)，Am J Clin Pathol.2003年12月；120增刊S101-27)。 肿瘤的早期检测和肿瘤生长监测被认为是成功治疗癌症患者的非常关键的因素。目前的诊断技术很大程度上依赖于成像和组织病理学。各种成像和扫描方法能根据不同的代谢活性或组织密度检测肿瘤块。其它成像技术，例如结肠镜检查和支气管镜检查(branchoscopy)通过腔室表面的直接成像而有助于鉴定肿瘤组织。这些方法的分辨率较低，为几毫米，此时肿瘤块早已含有大量肿瘤细胞(＞2×108)。在此阶段，肿瘤块的癌细胞可能脱落入血流，从而有可能引起转移。组织病理学方法能利用借助生物活检获得的组织样品来诊断肿瘤。虽然该方法能直接目测肿瘤细胞，但其在诊断或监测肿瘤中的应用有限。肿瘤的位置常使得获得生物活检样品不切实际。在其它情形中，通过暂时的一系列生物活检作周期性监测不能进行得太频繁，从而不能提供关于治疗效力和疾病进展的有用信息。目前组织病理学方法的另一重要限制是它们只能提供关于获得该生物活检的具体部位的数据，有可能忽略了在其它位置的转移。传统的组织病理学还可能是一危险的过程，在该过程中肿瘤组织或细胞可能污染远端位置，从而可能在生物活检流程中导致转移。 局限性肿瘤变成具有转移的恶性癌症的典型进展包括多个步骤。在较早的阶段，肿瘤块生长，细胞通过简单的扩散利用宿主组织中可用的营养。随后，一旦肿瘤块直径超过约1mm，肿瘤变得血管化，这是肿瘤细胞获得足够营养供给并维持其生长能力所需的步骤。血管化步骤部分由肿瘤细胞释放的血管生成因子驱动。随着肿瘤生长的进展，细胞丧失越来越多的起源组织特性，包括与毗邻细胞紧密相互作用的能力(参见，例如Blanco MJ，Moreno-Bueno G，Sarrio D，Locascio A，Cano A，Palacios J，Nieto MA，Correlation of Snailexpression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas(乳腺癌中蜗牛表达与组织学级别和淋巴结状态相关)，Oncogene.2002年5月9日；21(20)3241-6)。最终，少量肿瘤细胞渗入与肿瘤直接接触的血管。一旦进入循环，循环的肿瘤细胞可被携带至身体的远端部位。大多数这些细胞不适应血流中的环境，会死亡但仍留在循环系统中。然而，有时候一部分细胞碰巧或因为它们的特性更灵活而能在循环中存活较长时间。当循环肿瘤细胞进入远端区域的毛细血管时，其可能被截留在该位置。然后这些细胞会发生一系列事件从而粘附并穿过毛细血管的内皮壁而移位。如果肿瘤细胞在血流中的苛刻环境中活下来直至其穿过毛细血管壁，其能侵入周围组织并在新位置产生转移。 通常癌症生长的侵袭性越强，其形成转移越多，其越难治愈。可通过外科手术或化疗或联用二者治疗局限性肿瘤。然而，一旦癌细胞在身体的不同位置产生多个集落，则外科手术干预身体中的许多部位或多个器官不切实际且治疗价值有限。可用化疗治疗特征在于单或多转移的癌症。然而，即使在该情形中，治疗的成功亦有限，因为不同的癌症集落(原发性肿瘤和转移)对任何给定化疗的反应不同(El Hilali N，Rubio N，Blanco J.Different effect of paclitaxel onprimary tumor mass，tumor cell contents，and metastases for four experimentalhuman prostate tumors expressing luciferase(紫杉醇对表达萤光素酶的四种实验性人前列腺肿瘤的原发性肿瘤块、肿瘤细胞含量和转移的不同作用)，ClinCancer Res.2005年2月1；11(3)1253-8)不同癌症集落对治疗的反应不同主要有两个原因不同部位的癌细胞的遗传异质性和有差别地影响癌细胞存活的各种位置的局部环境因素。 所有这些考虑均强调了在早期阶段检测转移的重要性。然而，早期诊断的主要难点在于难以检测小的转移。转移可从原发性肿瘤脱落的单个细胞产生。目前的成像方法(X-射线、PET-扫描、CT-扫描)不能早期诊断转移，因为它们的灵敏度不足以检测单个转移细胞，而只能检测生长至几毫米直径并含有超过1亿细胞的转移。早期或在转移产生过程中检测循环中的癌细胞的能力有很大的临床关联性。虽然肿瘤块每日能脱落大量细胞，但临床相关体积(5-40mL)的任何给定血液样品中循环癌细胞的数量非常低。这些细胞在血液中存在的频率常是每107-108个白细胞有1个癌细胞。这样就非常难以在转移过程的早期分离和检测循环癌细胞。 肿瘤可以在不同组织，例如上皮和间充质组织中产生。大多数人实体瘤源自上皮细胞，所述上皮细胞的遗传材料和表型经历转化并能逃避使得细胞生长和细胞分裂受控的控制点。通常认为单一突变不足以产生癌细胞，而一系列突变是引发肿瘤所需。肿瘤细胞在遗传学上不稳定，其在疾病的整个发展过程中继续突变并产生变体。高度遗传不稳定性是在肿瘤细胞之间观察到异质性的源点。肿瘤中改变的细胞群进而成为进化竞争和选择的平台，其中分裂时间更快、代谢速度最高和分化级别最低的细胞易于快速生长和分裂，最终接管整个细胞群。由于不停产生新的突变和新的肿瘤细胞变体，肿瘤细胞群中维持高度多样性。 原发性肿瘤细胞中的遗传不稳定性和异质性没有临床后果，因为外科手术干预可除去整个肿瘤块及其所有细胞变体。然而，一旦该疾病达到转移癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集样品中靶细胞的方法，该方法包括：　ａ）通过将生物学样品中的ＷＢＣ与连接于固体支持物的特异性结合元件结合来除去它们；　ｂ）采用基于密度的方法除去该样品中的ＲＢＣ，从而产生富集了靶细胞类型的样品；和　ｃ）对富集了靶细胞 类型的样品实施分析、操作或应用步骤以测定靶细胞的数量或是否存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-7-14 60/831,1561.一种富集样品中靶细胞的方法，该方法包括a)通过将生物学样品中的WBC与连接于固体支持物的特异性结合元件结合来除去它们；b)采用基于密度的方法除去该样品中的RBC，从而产生富集了靶细胞类型的样品；和c)对富集了靶细胞类型的样品实施分析、操作或应用步骤以测定靶细胞的数量或是否存在。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是体液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是外科手术期间收集的血液或骨髓或组织。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物包括平均大小在10nm和10um之间的微粒。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物连接于结合WBC上存在的配体的特异性结合元件。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特异性结合元件是识别白细胞上表达的抗原的抗体。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗体是CD45和/或CD50。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于密度的方法包括离心。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于密度的方法利用含糖或糖衍生物的密度介质，从而在离心期间产生密度梯度。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述密度介质的分离效果与用缓冲液稀释至约80％和约100％之间的菲可相同。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固体支持物包括密度高于所述密度介质的密度的微粒。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基本上同时除去WBC和RBC。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析、操作或应用步骤包括以下一种或多种流式细胞术、PCR、免疫荧光、免疫细胞化学、图像分析、酶试验、基因表达概况分析、治疗剂效力测试、培养富集的稀有细胞和富集的稀有细胞的治疗性应用。14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是循环肿瘤细胞。15.一种从含有其它类型细胞的生物学样品中分离靶细胞的方法，所述方法包括a)通过选择性除去至少一种非靶细胞类型而不除去靶细胞来富集样品；b)通过减小样品体积而不除去靶细胞来压实样品；和c)对包含靶细胞的富集样品实施鉴定、表征或利用该靶细胞群的下游方法。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是癌性细胞。17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是血液样品。18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，至少一种非靶细胞类型是通过选择性裂解除去的。19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，至少一种非靶细胞类型是通过将非靶细胞选择性连接于固体支持物除去的。20.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：P林，A格蒂，W施，唐孟佳，G哈维，陶慧敏，陶国良，L吴，D瑟尼，J徐，
申请(专利权)人：阿维瓦生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]