一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，步骤如下：1）配制乙酸铵缓冲溶液；2）烟草及烟草制品的干燥、粉碎；3）粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取；4）提取完的样品室温高速离心，得第一上清液；5）在第一上清液中加入乙酸乙酯进行萃取净化后，离心得第二上清液；6）取第二上清液经氮气吹干、去离子水复溶，制得待测样品；7）通过LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。本发明专利技术的优点在于：样品前处理方法简单易行，利用乙酸铵缓冲溶液将烟草特有亚硝胺溶出，并通过乙酸乙酯液液萃取进行净化，除去了蛋白质和干扰物质，得到除杂后的精制样液，使得样品检测具有较高精确度，且提取效率高，操作简便、省时，试剂消耗量小。
【技术实现步骤摘要】
—种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法
本专利技术涉及烟草代谢组学烟草及烟草制品中特有亚硝胺(TSNAs )的样品前处理方法，具体是一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法。
技术介绍
烟草特有亚硝胺(TSNAs)包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4_甲基亚硝基吡啶基丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等，是烟草及烟草制品中的一类有害物质，其中NNN和NNK被国际癌症研究组织定义为Group 1-确认的人类致癌物。目前，对 TSNAs 的测定采用 LC-MS/MS 的分析方法，(CORESTA recommended method N 72 of61st Tobacco Science Research Conference)报道的样品前处理方法包括以下步骤:1)样品提取:称取均匀试样，加入乙酸铵缓冲溶液并进行超声提取，离心取上清液待用；2)提取液净化:将固相萃取柱装好，依次用甲醇、水和甲酸活化，取待净化提取液低速过柱，再用甲醇-水(5:95)淋洗，最后用甲醇-水(70:30)洗脱，合并收集洗脱液，浓缩蒸干，并加入去离子水复溶，进行LC-MS/MS测定。上述方法采用固相萃取小柱净化，利用其离子交换和反相保留的双重保留模式完成对样品的富集纯化。然而，该方法的前处理试剂消耗量大，每个样的净化处理需要13 mL的试剂，并且该方法提取液中的蛋白质会对固相萃取小柱造成堵塞，样品处理时间较长，每天只能完成20个样品的净化处理。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题在于现有技术中用LC-MS/MS检测烟草及烟草制品特有亚硝胺的样品前处理方法耗时长，试剂消耗量大，进而提供一种适用于简便、快速检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，包括以下步骤: 1)配制乙酸铵缓冲溶液； 2)烟草及烟草制品的干燥、粉碎； 3)粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取； 4)提取完的样品室温高速离心，得第一上清液； 5)在所述第一上清液中加入乙酸乙酯进行液液萃取净化后，离心得第二上清液； 6)取第二上清液经氮气吹干、复溶，制得待测样品； 7)采用LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。所述步骤I)中乙酸铵缓冲溶液的浓度为100禮，粉碎好的样品和乙酸铵缓冲溶液的用量比值介于1:40~1:20范围之间。。所述步骤3)中超声提取时间为30 min，频率为100 HZ。所述步骤4)和步骤5)中的离心速率为8000 rpm,时间为5 min。所述步骤5)中的乙酸乙酯和上清液的体积比为1:1。所述步骤6)中的复溶溶剂是去离子水。所述步骤2)中的烟草及烟草制品可为速冻的新鲜烟叶样品(冷冻干燥、粉碎机打碎)，也可为卷烟烟丝。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点: 本专利技术所述的样品前处理方法，利用乙酸铵缓冲溶液将烟草特有亚硝胺溶出，并通过乙酸乙酯液液萃取进行净化，得到除杂后的精制样液，即可通过LC-MS/MS进行目标化合物的检测。较之现有技术，本专利技术的前处理提取效率高，操作简便、省时，试剂消耗量小。本专利技术的样品前处理方法，还具有以下特点: I)有机试剂使用种类少,仅使用了乙酸乙酯。2 )提取时间短，样品重现性好(参见图5 )。3)浓缩步骤采用氮气吹干的方式，不仅可以同时对多个样品进行浓缩处理，效率较高，而且相较于旋转蒸发的方式，氮气吹干更适于样品的平行处理。4)操作安全便捷，能有效除去待测样品中的蛋白质分子和脂肪分子等，无需固相萃取柱的纯化富集，更适合大批量样品的测定。【附图说明】图1为本专利技术工艺流程图。图2为本专利技术方法实例I的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。图3为本专利技术方法实例2的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。图4为本专利技术方法实例3的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。图 2、3、4 中:从上到下依次为:TIC ;NNK_d4 ；NNK ;NAB_d4 ；NAB ；NAT-d4 ；NAT ；NNN-d4 ；NNNo图5为本专利技术方法对白肋烟烟叶进行了 6次重复提取和进样分析的烟草特有亚硝胺总离子流TIC图。【具体实施方式】本专利技术通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本专利技术。样品前处理实例1: 称取45~5O mg冻干处理的新鲜白肋烟烟叶样品于玻璃试管中，加入1.5 mL 100 mM乙酸铵缓冲溶液于玻璃管中(4种氘代TSNAs内标预先加入到乙酸铵缓冲溶液中，浓度分别为5 ng mL_1 NNN_d4,4 ng ml-1 NNK_d4,20 ng mL-1 NAT-d4,0.24 ng mL-1 NAB_d4),加盖密封后置于超声波清洗机内，在室温下超声抽提30 min，超声功率为100 HZ，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取0.8 mL上清液，在所述上清液中加入0.8 mL乙酸乙酯，加盖密封，室温震荡5 min,然后在8000 rpm的转速下离心5 min,取上清液0.4 mL并用氮气吹干,用0.4 mL去离子水复溶，转移到色谱分析瓶中进行LC-MS/MS分析。通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图2所示，各个定量离子对 NNK-d4 (212>126) ；NNK (208>122) ;NAB_d4 (196>166) ;NAB (192>162) ;NAT_d4(194>164)； NAT (190>160);NNN_d4 (182>152)；NNN (178>148)可达到基线分离并准确定量4种特有亚硝胺。样品前处理实例2: 称取2(T25 mg烤烟烟丝样品于玻璃试管中，加入0.75 mL 100 mM乙酸铵缓冲溶液于玻璃管中(4种氘代TSNAs内标预先加入到乙酸铵缓冲溶液中，浓度分别为5 ng mL—1 NNN-d4,4 ng mL—1 NNK_d4，20 ng mL—1 NAT_d4，0.24 ng mL—1 NAB_d4)，加盖密封后置于超声波清洗机内，在室温下超声抽提30 min，超声功率为100 HZ，然后在8000 rpm的转速下离心5 min,取0.4 mL上清液，在所述上清液中加入0.4 mL乙酸乙酯，加盖密封，室温震荡5 min，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取上清液0.2 mL并用氮气吹干，用0.2 mL去离子水复溶，转移到色谱分析瓶中进行LC-MS/MS分析。通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图3所示，各个定量离子对 NNK-d4 (212>126) ；NNK (208>122) ;NAB_d4 (196>166) ;NAB (192>162) ;NAT_d4(194>164)； NAT (190>160);NNN_d4 (182>152)；NNN (178>148)可达到基线分离并准确定量4种特本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种LC‑MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：配制乙酸铵缓冲溶液；烟草及烟草制品的干燥、粉碎；粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取；提取完的样品室温高速离心，得第一上清液；在所述第一上清液中加入乙酸乙酯进行萃取净化后，离心得第二上清液；取第二上清液经吹干、复溶，制得待测样品；采用LC‑MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。
【技术特征摘要】
1.一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤: 配制乙酸铵缓冲溶液； 烟草及烟草制品的干燥、粉碎； 粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取； 提取完的样品室温高速离心，得第一上清液； 在所述第一上清液中加入乙酸乙酯进行萃取净化后，离心得第二上清液； 取第二上清液经吹干、复溶，制得待测样品； 采用LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于:步骤I)中乙酸铵缓冲溶液的浓度为100禮，粉碎好的样品与乙酸铵缓冲溶液的用量比值介于l:4(Tl:20范围之间。3.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于:步骤3)中超声提取时...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈霞，周会娜，金立锋，陈千思，刘萍萍，翟妞，郑庆霞，卢鹏，王燃，魏春阳，杨军，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。