三功能T细胞抗原偶联物及其制备方法和用途技术

提供了三功能分子，其包含靶标特异性配体、结合与TCR复合体相关的蛋白的配体和T细胞受体信号传导结构域多肽。具有该新型受体的工程化T细胞引起许多T细胞功能的抗原特异性激活，包括细胞因子产生、细胞脱颗粒和细胞溶解。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求于2014年2月7日提交的美国临时专利申请第61/936,906号的优先权，所述临时专利申请的内容据此通过引用整体并入。领域本公开涉及通过具有针对特定靶细胞的高细胞毒性和降低的脱靶毒性的工程化T细胞来治疗癌症的方法。具体地，本公开涉及表达模拟自然的T细胞活化过程的新型生物制剂的工程化T细胞。专利技术背景癌症是主要的健康挑战，其中仅在2013年，在加拿大预期诊断出超过150,000例癌症。虽然患有早期疾病的患者可以通过常规疗法(外科手术、辐射、化疗)进行有效地治疗，但患有晚期疾病的患者可利用的选择很少，并且那些选择在本质上通常为缓和性的。主动免疫疗法寻求采用患者的免疫系统来清除肿瘤种植并且为常规疗法失效的患者提供令人激动的选择(Humphries,2013)。事实上，若干临床研究已经证明T细胞的免疫疗法在患有晚期黑素瘤的患者中可以为有疗效的，从而证实了该方法的效用(Humphries,2013)。此外，罹患慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者也用T细胞免疫疗法得到有效治疗和治愈(Fry和Mackall,2013)(Kochenderfer和Rosenberg,2013)。虽然存在若干免疫治疗方法，但具有嵌合受体的工程化T细胞使任何患者的免疫细胞以主要组织相容性复合体(MHC)独立性方式靶向任何期望靶标。迄今为止，用于工程化T细胞的嵌合受体由以下组成：靶向结构域，通常为单链可变片段(scFv)；跨膜结构域；和胞质结构域，其含有来自T细胞受体的信号传导元件和相关蛋白(Dotti等人,2009)。此类嵌合受体已被称为“T体(T-body)”、“嵌合抗原受体”(CAR)或“嵌合免疫受体”(CIR)-目前，大多数研究人员使用术语“CAR”(Dotti等人,2009)。这些CAR以模块化术语被考虑并且科学家已经花费了相当长的时间研究不同的细胞质信号传导结构域对CAR功能的影响。第一代CAR采用来自CD3ζ或FcεRIγ的单个信号传导结构域。第二代CAR将CD3ζ的信号传导结构域与来自CD28或TNFR家族受体的共刺激受体的细胞质结构域组合(Dotti等人,2009)。第三代CAR组合了多个共刺激结构域，但存在担忧的是：第三代CAR可能失去抗原特异性(Han等人,2013)。在临床中试验的大多数CAR-工程化的T细胞采用第二代CAR，其中CD3ζ与CD28或CD137的细胞质结构域偶联(Han等人,2013)(Finney等人,2004)(Milone等人,2009)。虽然CAR-工程化的T细胞已经显示出临床应用的相当大的希望，但是它们依赖合成方法来替代T细胞受体(TCR)提供的激活信号。由于该合成受体不递送所有与TCR相关的信号传导组分(例如CD3ε、Lck)，所以仍不清楚的是，T细胞是否被CAR以最佳方式激活或者CAR活化如何影响T细胞分化(例如进展至记忆T细胞)。而且，由于CAR信号传导结构域通过CAR结构的特有性质从它们的天然调控伴侣分离，所以还存在这样的固有风险：CAR可导致低水平的组成型激活，这可产生脱靶毒性。考虑到这些局限性，优选的是重定向T细胞以经由其天然的TCR攻击肿瘤。为此，构建了一类被称为“双特异性T细胞衔接器”(BiTE)的重组蛋白(Chames和Baty,2009)(Portell等人,2013)。这些蛋白采用双特异性抗体片段以将T细胞TCR受体与靶抗原交联。这导致T细胞有效激活，从而触发细胞毒性。类似地，已产生实现该目标的双特异性抗体并且一些科学家采用化学连接将抗-CD3抗体与肿瘤特异性抗体简单地连接(Chames和Baty,2009)。虽然这些双特异性蛋白已在体外显示出一些活性，但GMP产生、短的生物半衰期和生物利用度代表这些分子在癌症治疗中成功使用的重大挑战。此外，这些分子也不能正确地重现天然的TCR信号传导，因为它们未使TCR共受体(CD8和CD4)参与。因此，与传统的CAR相比，仍需要具有增强的活性和安全性的T细胞抗原偶联物。专利技术概述本专利技术人已经证明，与传统的嵌合抗原受体相比，三功能T细胞抗原偶联物具有增强的活性和安全性，所述三功能T细胞抗原偶联物通过T细胞受体(TCR)更好地模拟了天然的信号传导，同时保留了主要组织相容性复合体的不受限制的靶向。因此，本公开的一个方面提供了核酸，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。本公开的另一方面提供了由上文所述的核酸编码的多肽。本公开的另一方面提供了包含上文所述的核酸的表达载体。本公开的另一方面提供了表达上文所述的核酸的T细胞。本公开的另一方面提供了包含T细胞和载体的药物组合物。本公开还提供了T细胞在有需要的对象中治疗癌症的用途，其中所述T细胞表达核酸，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。在一个实施方案中，靶标特异性配体结合癌细胞上的抗原。在另一实施方案中，靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。在另一实施方案中，与TCR复合体相关的蛋白为CD3。在另一实施方案中，结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。在另一实施方案中，结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。在另一实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。在另一实施方案中，胞质结构域为CD4胞质结构域并且跨膜结构域为CD4跨膜结构域。在另一实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸与第二多核苷酸融合。在另一实施方案中，第二多核苷酸和第三多核苷酸与第一多核苷酸融合。本公开还提供了载体构建体，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽，和d.在哺乳动物细胞中有功能的启动子。在一个实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸与第二多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。在另一实施方案中，第二多核苷酸和第三多核苷酸与第一多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与启动子可操作地连接。本公开还提供了用载体构建体转染的分离的T细胞。本公开的其它特征和优势将从下述详述中变得显而易见。然而，应理解，虽然指示本公开的优选实施方案，但该详述和具体实例仅通过示例给出，因为从此详述中，本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。附图简述图1为相比于常规的二代CAR，三功能T细胞抗原偶联物(Tri-TAC)的图解性概述。包括在本工作中使用的构建体的示意图。图2显示Tri-TAC变体和经典CAR的表面表达分析。图3显示查看不同的标志物IFN-γ、TNF-α和CD107a的细胞活化的分析。图4分析表达(D2F2E2)或不表达(D2F2)经典CAR和Tri-TAC的分子靶标的两种不同细胞系的杀伤。图5描本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.07 US 61/936,9061.核酸，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽。2.如权利要求1所述的核酸，其中所述靶标特异性配体结合肿瘤抗原。3.如权利要求1或2所述的核酸，其中所述靶标特异性配体为设计的锚蛋白重复(DARPin)多肽或scFv。4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸，其中所述与TCR复合体相关的蛋白为CD3。5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为单链抗体。6.如权利要求1-5中任一项所述的核酸，其中所述结合与TCR复合体相关的蛋白的配体为UCHT1或其变体。7.如权利要求1-6中任一项所述的核酸，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含胞质结构域和跨膜结构域。8.如权利要求7所述的核酸，其中所述胞质结构域为CD4胞质结构域并且所述跨膜结构域为CD4跨膜结构域。9.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合。10.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合。11.多肽，其由权利要求1-10中任一项所述的核酸编码。12.表达载体，其包含权利要求1-10中任一项所述的核酸。13.T细胞，其表达权利要求1-10中任一项所述的核酸。14.载体构建体，其包含：a.第一多核苷酸，其编码靶标特异性配体；b.第二多核苷酸，其编码结合与TCR复合体相关的蛋白的配体；以及c.第三多核苷酸，其编码T细胞受体信号传导结构域多肽，和d.在哺乳动物细胞中有功能的启动子。15.如权利要求14所述的载体构建体，其中所述第一多核苷酸和第三多核苷酸与所述第二多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且所述T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与所述启动子可操作地连接。16.如权利要求14所述的载体构建体，其中所述第二多核苷酸和第三多核苷酸与所述第一多核苷酸融合以提供T细胞抗原偶联物的融合物并且所述T细胞抗原偶联物的融合物的编码序列与所述启动子可操作地连接。17.如权利要求14-16中任一项所述的载体构建体，其中所述靶标特异性配体结合肿瘤抗原。18.如权利要求14-17中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳森·布拉姆森，克里斯托弗·W·赫尔森，嘉琳娜·丹尼索瓦，雷佳尼什·吉里，肯尼斯·安东尼·牧瓦瓦司，
申请(专利权)人：麦克马斯特大学，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA