用于预防或治疗宫颈癌的、包含人乳头瘤病毒变形体及免疫增强剂的组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于预防或治疗包括人乳头瘤病毒变形体及免疫增强剂的宫颈癌的组合物。更具体地，融合蛋白通过诱导HPV16及18型抗原特异性免疫应答治疗由HPV引起的肿瘤，所述融合蛋白包括：融合多肽，该融合多肽被重组以使人乳头瘤病毒16及18型的抗原E6、E7的三维结构变形；信号肽，该信号肽用于分泌所述融合多肽；和免疫增强肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于预防或治疗宫颈癌的、包含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus；HPV)变形体及免疫增强剂的组合物。更具体地，融合蛋白通过诱导HPV16和18型抗原特异性免疫应答治疗由HPV引起的肿瘤。所述融合蛋白包括融合多肽(Polypeptide)、信号肽及免疫增强肽，所述融合多肽被重组，以使作为人乳头瘤病毒16和18型的抗原E6、E7的三维结构变形。
技术介绍
众所周知，宫颈癌(cervicalcancer)是由于受人乳头瘤病毒16和18型等的高危型人乳头瘤病毒的感染而引起的疾病(zurHausen,Hetal.BiochemBiophysActa1996,1288；F55-F78,MarkHetal.JNatlCancerInst1993,85；958-964)。在HPV蛋白中E6、E7蛋白对宫颈癌的发病起主要作用，而且已确认在宫颈癌患者的肿瘤组织中表达99％，从而成为制备用于治疗和预防宫颈癌的疫苗的主要靶物质(vonKnebelDoeberitzetal.Int.J.Cancer1992,51；831-834)。E6与已知用作肿瘤抑制蛋白p53结合，通过促进p53的分解，用细胞凋亡(apoptosis)途径阻止细胞周期的进行。E7与作为肿瘤抑制因子的视网膜母细胞瘤蛋白pRb(retinoblastomaprotein)结合，通过使之失活并促进其分解，诱导细胞周期进入S期(Cobriniketal.,TrendsBiochemSci1992,17:312-5)。然而，为治疗宫颈癌，在使用通过同时表达HPV16的E6、E7蛋白的核酸序列的组合物的临床试验中，其疗效并不显著(GarciaFetal.ObstetGynecol2004,103；317-326)。此结果表明，仅施用HPV抗原是无法发生足以治疗或抑制宫颈癌的抗原特异性免疫应答的。因此，为治疗子宫癌，需增强E6、E7的免疫原性(immunogenicity)，并且需消除所述蛋白的致癌能力。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于，提供用于预防或治疗由HPV引起的疾病的新型融合蛋白及编码所述融合蛋白的多核苷酸(polynucleotide)。所述融合蛋白可抑制HPVE6、E7蛋白的致癌能力并展现增强的免疫原性。本专利技术的另一个目的在于，提供表达所述融合蛋白的重组载体(recombinantvector)、包含所述载体的宿主细胞以及用所述宿主细胞表达融合蛋白的方法。本专利技术的另一个目的在于，提供用所述融合蛋白的、用于预防或治疗由HPV引起的疾病的组合物。本专利技术的另一个目的在于，提供用所述组合物的、用于预防或治疗由HPV引起的疾病的方法。技术方案为达到上述目的，一方面，本专利技术提供融合蛋白，该融合蛋白包括：融合多肽，即三维结构变形的、源于人乳头瘤病毒16和18型并包含SEQIDNO：1氨基酸序列的E6、E7；用于分泌所述融合多肽的信号肽；和免疫增强肽。另一方面，本专利技术提供多核苷酸，该多核苷酸用于编码本专利技术的融合蛋白。另一方面，本专利技术提供重组载体，该重组载体包括本专利技术的多核苷酸。另一方面，本专利技术提供宿主细胞，该宿主细胞由本专利技术的重组载体转化而成。另一方面，本专利技术提供用于表达本专利技术的融合蛋白的方法，该方法是通过培养本发明的经转化的宿主细胞完成的。另一方面，本专利技术提供用于预防或治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的组合物，该组合物包括作为活性成分的、选自本专利技术的融合蛋白、由表达所述融合蛋白的重组载体转化而成的宿主细胞及其均浆(homogenate)中的一种或多种的物质。另一方面，本专利技术提供用于预防或治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法，该方法包括向需要者施用有效剂量的本专利技术的组合物的步骤。有益效果本专利技术所制备的融合蛋白通过诱导高的HPV16和18型抗原特异性免疫应答来治疗由HPV引起的肿瘤，所述融合蛋白包括为改变源于HPV16和18型E6、E7蛋白的三维结构而被重组的融合蛋白、用于向细胞外分泌该融合蛋白的信号肽及免疫增强肽。附图说明图1展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本专利技术的GX-188E治疗后展示的HPV16的E6特异性CD8+T细胞应答的图。图2展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本专利技术的GX-188E治疗后展示的HPV16的E7特异性CD8+T细胞应答的图。图3展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本专利技术的GX-188E治疗后展示的HPV18的E6特异性CD8+T细胞应答的图。图4展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本专利技术的GX-188E治疗后展示的HPV18的E7特异性CD8+T细胞应答的图。图5展示了对抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞株TC-1并经过本专利技术的GX-188E治疗后展示的抗癌效果的图。具体实施方式下面将详细地说明本专利技术的内容。本专利技术涉及融合蛋白，该融合蛋白包括：源于人乳头瘤病毒16及18型并包含SEQIDNO:1氨基酸序列的三维结构变形的E6、E7融合多肽；用于分泌所述融合多肽的信号肽；和免疫增强肽。本专利技术的融合蛋白包括融合多肽，该融合多肽被重组以使源于人乳头瘤病毒16及18型的E6、E7的三维结构变形。更具体地，所述融合多肽由源于人乳头瘤病毒16型的E6蛋白的第1～85位的氨基酸、E7蛋白的第1～65位的氨基酸、E6蛋白的第71～158位的氨基酸、E7蛋白的第51～98位的氨基酸和源于人乳头瘤病毒18型的E6蛋白的第1～85位的氨基酸、E7蛋白的第1～65位氨基酸、E6蛋白的第71～158位的氨基酸、E7蛋白的第51～105位的氨基酸组成。最为具体地，融合多肽可包含SEQIDNO：1的氨基酸序列。此外，所述信号肽指包括约20～30个氨基酸的肽，所述肽能将在细胞内表达的蛋白，尤其将包含E6、E7融合多肽的蛋白分泌至细胞外。而且，用于编码所述肽的核酸序列被称为“分泌信号序列”。由于本专利技术的E6、E7融合多肽是在受病毒感染的细胞的核内表达的蛋白(nucleusprotein)，其免疫力弱。因此，由分泌信号序列表达的信号肽诱导三维结构变形的E6、E7分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答(humoralimmuneresponse)及细胞免疫应答(cellularimmuneresponse)。所述信号肽可使用包括哺乳动物等的高等真核细胞内的信号肽，如tPA本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码融合多肽的多核苷酸，其特征在于，所述融合多肽用于转换源自人乳头瘤病毒16及18型并具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的E6和E7的三维(3D)结构。

【技术特征摘要】
1.编码融合多肽的多核苷酸，其特征在于，所述融合多肽用于转换源自人乳头瘤病毒16及18型并具
有如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的E6和E7的三维(3D)结构。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包括编码免疫增强肽的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述免疫增强肽选自CD40配体、fms样酪氨酸激
酶3(Flt3)配体和鞭毛蛋白。
4.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码免疫增强肽的核酸序列包括如SEQIDNO:6
所示的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包含编码信号肽的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述信号肽选自组织型纤溶酶原激活物(tPa)信
号肽、单纯疱疹病毒糖蛋白Ds(HSVgDs)信号肽和生长激素信号肽。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码信号肽的核酸序列包含如SEQIDNO:5
所示的核酸。
8.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，其经过密码子最优化。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，其包含如SEQIDNO:4所示的核酸序列。
10.一种多核苷酸，包含：编码对应于人乳头瘤病毒(HPV)16分型的E6蛋白的第1个-第85个氨
基酸的氨基酸序列的核酸序列，编码对应于HPV-16分型的E7蛋白的第1个-第65个氨基酸序列的核
酸序列，编码对应于HPV-16分型的E6蛋白的第71个-第158个氨基酸序列的核酸序列，编码对应于
HPV-16分型的E7蛋白的第51个-第98个氨基酸序列的核酸序列，编码对应于HPV-18分型的E6蛋
白的第1个-第85个氨基酸序列的核酸序列，编码对应于HPV-18分型的E7蛋白的第1个-第65个氨
基酸序列的核酸序列，编码对应于HPV-18分型的E6蛋白的第71个-第158个氨基酸序列的核酸序列，
以及编码对应于HPV-18分型的E7蛋白的第51个-第105个氨基酸序列的核酸序列。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包含编码免疫增强肽的核酸序列。
12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包含编码信号肽的核酸序列。
13.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，进一步包含编码信号肽的核酸序列。
14.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，其经过密码子最优化。
15.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码免疫增强肽的核酸序列经过密码子最优
化。
16.根据权利要求12或13所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码信号肽的核酸序列经过密码子最
优化。
17.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，其包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5和SEQIDNO:
6的核苷酸序列。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：成永喆，徐相焕，徐裕锡，
申请(专利权)人：株式会社吉耐森，
类型：发明
国别省市：韩国;KR