治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物制造技术

本发明专利技术公开了一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。本发明专利技术提供的疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成。本发明专利技术提供的疫苗对于宫颈癌的治疗和预防均由显著效果，具有很大的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和疫苗领域，具体涉及一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。
技术介绍
Human papillomavirus病毒(HPV)属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤病毒属，是一种嗜上皮细胞的DNA病毒。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是宫颈癌的主要致病因子，约90%以上的宫颈癌发病都与HPV感染有关，宫颈癌占全世界妇女癌症死亡率的第二位，在某些发展中国家甚至位居首位。由于大约50%的宫颈癌与HPV16 感染相关，因而研制针对HPV16的治疗性疫苗将对宫颈癌的治疗具有十分重要的意义。HPV基因组主要编码2种晚期蛋白(Li和L2)和6种早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6 和E7)。晚期蛋白为HPV衣壳结构成分，参与病毒颗粒组装。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化，HPV相关肿瘤中组成型持续表达E6和E7 蛋白，E6和E7基因只存在于癌变组织中，在正常组织中不存在。由于HPV16 E6和E7基因为癌基因，直接应用于疫苗设计有潜在的危险性。为了保证疫苗的安全性，必须进行相应的基因突变以消除其致癌性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种治疗和/或预防宫颈癌的基因工程药物。本专利技术提供的宫颈癌治疗和/或预防疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成。所述重组质粒甲为质粒。所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒pBH Glox AEl\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在PDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。所述重组质粒甲具体可为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2 所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。所述疫苗中，所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列 1所示。所述疫苗中，所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒在制备宫颈癌治疗和/或预防疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述重组质粒甲为质粒。所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒PBH GlOXΔEl\3Cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在PDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。所述重组质粒甲具体可为在pVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2 所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。所述应用中，所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列 1所示。所述应用中，所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装。上述疫苗可采用如下方法对成人进行免疫第一次免疫免疫(肌肉注射)所述重组质粒甲，免疫剂量为4-5mg DNA ；第二次免疫；第一字免疫2周后，免疫所述重组腺病毒，免疫(肌肉注射)剂量为2X IO11病毒粒子。实验证明，本专利技术提供的疫苗对于宫颈癌的治疗和预防均由显著效果，具有很大的临床应用前景。附图说明图 1 为重组质粒 pDC315 HPV16 omfE6E7_3 的 EcoRI/BamHl 酶切鉴定图； 1-3 质粒 pDC315 HPV16 omfE6E7-3 的 EcoRI/BamHl 酶切产物；4 重组质粒 pDC315 HPV16omfE6E7-3 (未酶切)；M 为 Marker。图2为重组腺病毒RCA电泳检测结果；1 :pXC-l质粒的PCR产物；2 :pXC-l质粒 10倍稀释液的PCR产物；3 :pXC-l质粒100倍稀释液的PCR产物；4 病毒上清的PCR产物； 5 病毒上清10倍稀释液的PCR产物；6 病毒上清100倍稀释液的PCR产物；7 =Wide Range DNA Marker(100-6000)。图3为重组腺病毒中目的基因PCR电泳鉴定结果。1 病毒上清的PCR产物；2 病毒上清10倍稀释液的PCR产物；3 病毒上清100倍稀释液的PCR产物；4 =Wide Range DNAMarker(100-6000)。图4为重组腺病毒感染细胞后表达的目的蛋白的Western blot结果；其中A为采用E6山羊多抗作为一抗，E7山羊多抗作为一抗；1 蛋白Marker ；2 重组腺病毒；3 对照腺病毒；4 未感染腺病毒的HEK293细胞。图 5 为重组质粒 pVR1012-HPV16omfE6E7-3 的酶切鉴定图(EcoR V/Bgl II) ； 1-4 重组质粒 pVR1012-HPV16omfE6E7-3 的 EcoR V/Bgl II 酶切产物；M =Marker0图6为HPV16 ofE6E7_l原核细胞表达蛋白的纯化产物(HPV16-E6E7抗原)的 SDS-PAGE 电泳图；M =Marker ； 1-3 纯化后的 HPV16 ofE6E7_l 融合蛋白(HPV16-E6E7 抗原)。图7为实施例3中ELISA法检测体液免疫反应的结果；A :免疫后1周(第7天) 时IgG OD值(1 1600稀释血清)；B 免疫后4周(第观天)时IgG OD值(1 1600稀释血清)。图8为实施例3中ELISP0T法鉴定细胞免疫的结果。图9为重组质粒和重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。图10为重组质粒和重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术所涉及到的分子生物学相关技术如核酸分子克隆技术、蛋白质表达检测等在科学文献中都已经有充分的描述(如参见J.萨姆布鲁克、E. F弗里奇、T.曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))，涉及到各种试剂盒的具体操作，按照其相应说明书进行。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。限制性内切酶Hindlll、EcoR I, BamH 1，14连接酶，PCR EXTaq酶均购自日本TAKARA 公司。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、大肠杆菌DH5 α感受态细胞购自北京天根公司。FuGENE-HD(转染试剂)购自Roch公司。Elispot set购自 MABPTECH公司。E6山羊多抗和E7小鼠单抗购自santa cruz公司。山羊二抗和小鼠二抗购自rockland公司。引物均由上海生工合成。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物所。 PDC315质粒来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01—64)。 骨架质粒 pBH Glox Δ El\3cre 来自加拿大 Microbix Biosystems Inc.公司销售的 Admax kitD(PD-01-64) ο HEK 293 细胞购买自美国本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．宫颈癌治疗和／或预防疫苗，其活性成分由含有序列表的序列２所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列２所示蛋白质的重组腺病毒组成。

【技术特征摘要】
1.宫颈癌治疗和/或预防疫苗，其活性成分由含有序列表的序列2所示蛋白质的编码基因的重组质粒甲和表达所述序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒组成。2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述重组腺病毒是培养重组细胞得到的重组腺病毒；所述重组细胞是将重组质粒乙与骨架质粒PBH GlOXΔEl\3Cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒乙是在PDC315质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述重组质粒甲为在PVR1012质粒的多克隆位点插入所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因得到的重组质粒。4.如权利要求1或2或3所述的疫苗，其特征在于所述序列表的序列2所示蛋白质的编码基因如序列表的序列1所示。5.如权利要求1至4中任一所述的疫苗，其特征在于所述重组质粒甲和所述重组腺病毒分别单独包装...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾毅，周志祥，张立娜，徐银胜，李泽琳，盛望，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：11