人G-CSF的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种改进的高产量生产G-CSF的方法，其通过在生产期期间高盐诱导增加质粒稳定性来实现。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改进的高产量生产G-CSF的方法，其通过在生产期期间高盐诱导增加质粒稳定性来实现。
技术介绍
细胞因子粒细胞集落刺激因子(GranulocyteColony Stimulating Factor,G-CSF)治疗显著改善了患有严重的慢性中性白细胞减少患者的生活质量[Jones等JAMA270 :1132-1133(1993)]。G-CSF是从骨髓储备释放粒细胞以及增强其抗微生物活性的强效的内源触发剂。G-CSF在急性疾病的多种临床前模型中被广泛评估，并且一般都得到了很有希望的结果[Marshall J. C. Shock 24 120-9 (2005) ] 0由于其在化疗周期中得到证实的功效，G-CSF成为肿瘤学中重要的生物技术药物。G-CSF已被克隆并在多种类型的细胞中表达，例如微生物细胞[Souza L. M. Science 232:61-65(1986) ；Hu Z. Y等Zhongguo ShenghuaYaowu Zazhi (1999), 20 :55-57]、酵母细胞[Lasnik M. A.等 Biotechnol. Bioeng. 81 768-774(2003) ；Lee S. M.等韩国专利 KR 160934B119981116]、水稻细胞[Hong 等 ProteinExpr Purif.在线发表(2005)]、猫细胞[Yamamoto 等Gene 274 :263-269 (2001)]、中国仓鼠卵巢细胞[Monaco L.等 Gene. 180 :145-150 (1996)]、昆虫细胞[Shinkai 等 Protein Expr.Purif. 10 :379-385(1997)],甚至在转基因山羊中表达[Ko J. H 等 Transgenic Res. 9 215-22 (2000)] 0用于药物用途的G-CSF主要在大肠杆菌(Escherichia coli)中以包涵体的形式生产[Jevsevar S.等 Biotechnol. Prog. 21 :632_639 (2005)],所述包涵体是非天然构象的重组蛋白形成的不溶聚集物[Baneyx F. &Mujacic M. Nature Biotechnol. 22 1399-1408 (2004)],其通常不具有生物活性[Bernardez C. E. Curr. Opin. Biotechnol. 9 157-163(1998)]。G-CSF 的分泌生产技术也已报道[Jeong KJ. & Lee S. Y. Protein ExprPurif. 23 :311-318(2001) ；Lee S. Y.等 Methods Mol. Biol. 308 :31-42 (2005)]。分泌表达通常导致正确折叠形式的G-CSF释放到周质空间或细胞外培养基中，但是产量比通过包涵体形式获得的要少得多。因此，在大肠杆菌中以包涵体形式表达G-CSF具有商业优势。可以以商业上可行的方式，在分离和溶解包涵体后采用变性和复性方法容易地从包涵体获得正确折叠的、具有生物活性的 G-CSF 蛋白[Rudolph R,在 Protein Engineering principlesand Practice 中；Cleland, J. L.，Craik, S. C.,电子数据系统；ffiley-Liss, Inc. NewYork，1996 ;283-298 页；Rathore A. S.等 J Pharm Biomed Anal. 32 :1199-1211 (2003)]。在大肠杆菌中生产重组蛋白最有效的方法之一是补料-分批发酵，其可以以循环和非循环的模式进行。非循环方法较不复杂，因此更适于工业生产。事实上，现有技术记载了利用非循环的补料-分批方法生产GCSF的最高产量之一为4. 2-4. 4g/L[Yim SC等 Bioprocess and Biosystems Engineering (2001, 24, 249-254]。为获得更高的累积量、而以循环模式进行补料-分批发酵造成质粒的高不稳定性[Choi S. -J.等J. Microbiol.Biotechnol. 10 :321-326 (2000)],从而限制了该方法的稳健性(robustness)。通常，为了使产物高表达，需要将含有产物基因的染色体外质粒以其合适的形式保持在细胞中。这通常通过向培养基加入合适的抗生素以对重组微生物保持选择压力来实现。已有报道，通过在发酵过程中每1-2小时加入抗生素(氨苄青霉素)以降低重组菌株的“分离不稳定性(segregational nonstability) ” 来提高 G-CSF 的表达水平(KrivopalovaG.N.等俄罗斯专利RU 2158303C220001027)。从终产物清除抗生素的调控需要必然使其应用受到限制。越是大量使用抗生素，越是可能对环境产生不良影响。但是降低抗生素选择压力常常导致质粒稳定性和表达水平的降低，这削弱了该方法的稳健性。因此，在限制抗生素使用的同时提高质粒的稳定性和产物的表达水平(特别是在生产期)是一个技术上的挑战。此外，通常在大体积的培养物中，生产期期间的质粒低稳定性也可由代谢压力所致[Saraswat V.等 FEMS Microbiol. Lett. 179 :367-373 (1999)]，并可能造成低表达水平 [Cheng C. et al Biotechnol. Bioeng. 56 :23-31 (1997)]。除了保持抗生素的高选择压力，还可以在载体构建水平上提高质粒的稳定性[Schweder T.等 Appl Microbiol Biotechnol. 38:91-93(1992) ；PanS. H.和 MalcomB. A. Biotechniques. 29 :1234-1238 (2000)]。实践中，可以通过调整培养条件(例如避免营养饥饿)来提高质粒稳定性[Smith &Bidochka Can. J. Microbiol. 44 :351-355 (1998)]。当实施大规模的底物限制性补料-分批方法时，营养受限/饥饿极易发生，并且在低复杂度的方法中过于频繁或大量地加入抗生素以维持高产量和质粒高稳定性也是不切实际且昂贵的解决方案。因此，需要开发一种使用简单而稳定的方法来保持质粒高稳定性从而制备高体积产量G-CSF的替代方法。
技术实现思路
本专利技术描述了一种在大肠杆菌中以高体积产量(volumetric yield)生产粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的非循环式补料-分批方法，其通过在生产培养基和培养液中高浓度联合使用钾离子与镁离子或钠离子来保持培养物中质粒高稳定性来实现。附图说明图I显示在生产期中使用高浓度的钾和钠阳离子对分批收获时BL21 (DE3)细胞中含有G-CSF基因的质粒稳定性的影响。在生产期中，在第2批中使用高浓度的钾盐和钠盐，而在第I批中则不使用高浓度的钾盐和钠盐。各批在30L发酵罐中单独进行。图2显示在生产期中使用高浓度的钾和钠阳离子对所收获批次中G-CSF体积产量的影响。在生产期中，在第2批中使用高浓度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产G？CSF的方法，其包括如下步骤：i)将合适的大肠杆菌培养物接种至发酵罐，所述大肠杆菌培养物预先已用编码G？CSF的合适表达载体进行转化；ii)用合适的培养液进行分批及补料分批模式以提高生物量；iii)向所述培养液中加入合适的生产培养基，其中所述培养液包含至少5g/L的硫胺素。

【技术特征摘要】
2006.03.06 IN 309/MUM/20061.一种生产G-CSF的方法，其包括如下步骤 i)将合适的大肠杆菌培养物接种至发酵罐，所述大肠杆菌培养物预先已用编码G-CSF的合适表达载体进行转化； ii)用合适的培养液进行分批及补料分批模式以提高生物量； iii)向所述培养液...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑吉夫·库玛·门迪拉塔，维伯尔·萨拉斯沃特，潘卡伊·R·帕特尔，
申请(专利权)人：卡迪拉保健有限公司，
类型：发明
国别省市：