具有优异免疫学特性的优异的人乳头瘤病毒抗原和含有其的疫苗制造技术

本发明专利技术提供编码数种血清型的多种HPV抗原的基因。本发明专利技术的基因产生具有改善的免疫学品质和四级结构的病毒样颗粒。本发明专利技术还提供了合适的宿主细胞，优选具有高拷贝数的编码数种血清型的多种HPV抗原之基因的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。本发明专利技术还提供了具有改进的免疫接种程序的针对HPV抗原的疫苗，其中减少了疫苗剂量方案和抗原的量。本发明专利技术还提供了使用酵母的经改进人乳头瘤病毒疫苗组合物。

An excellent human papillomavirus antigen with excellent immunological properties and a vaccine containing the same

The present invention provides a gene encoding a plurality of HPV antigens of several serotypes. The gene of the invention produces a virus like particle having improved immunological quality and a four order structure. The present invention also provides Pasteur P.pastoris, a suitable host cell, preferably with a high copy number encoding a variety of serotypes of a HPV antigen gene. The present invention also provides vaccines against HPV antigens with improved immunization procedures, in which the dosage regimen and the amount of antigen are reduced. The present invention also provides an improved human papillomavirus vaccine composition using yeast.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有优异免疫学特性的优异的人乳头瘤病毒抗原和含有其的疫苗
本专利技术涉及编码人乳头瘤病毒抗原的基因及其在疫苗开发中的用途，特别是用于在人类中预防人乳头瘤病毒感染的用途。本专利技术还提供了使用酵母的经改进人乳头瘤病毒疫苗组合物。
技术介绍
世界范围内，宫颈癌是在妇女中第二大常见的癌症，其造成每年274,000例死亡。印度宫颈癌的发病率约为每年132,000例，占亚太地区记录疾病发病率的近52％。在印度每年有将近73,000名妇女死于宫颈癌；因此其保有占据了全球记录的所有宫颈癌死亡的近四分之一的不光彩的名声。据估计到2025年，发展中世界的发病率将占全球发病率的近80％。人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是大小约8kb的趋上皮性双链DNA病毒。HPV基因组编码非结构蛋白质(E1、E2、E4、E5、E6和E7)和结构蛋白质(L1和L2)。报告有120多种HPV类型。高风险HPV类型的持续感染是诱导宫颈癌的唯一最重要的因素。在高风险HPV类型中，HPV16和18是全世界最常与宫颈癌相关的基因型。发现印度宫颈癌中的总体HPV类型发生率为以下顺序：HPV16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59和HPV68。在印度，HPV16和HPV18类型共同贡献了全部宫颈癌发病率的将近80％。目前，在全球市场上使用了两种宫颈癌疫苗：由Merck&Co.Inc.生产的四价HPV(qHPV)疫苗(Merck，Rahway，NJ，美国)；和由GlaxoSmithKlineplc.生产的二价HPV疫苗(CervarixTM，GSK，Middlesex，英国)。Gardasil由美国食品和药物管理局(FDA)于2006年6月批准，其针对四种HPV毒株进行保护——HPV6、11、16和18。虽然有超过100种HPV毒株，但某些类型特别可能与癌症有关；毒株16和18与美国所有宫颈癌病例的70％相关。毒株6和11与90％的生殖器疣相关。在临床试验中，疫苗在以前未感染过的女性中预防这四种毒株的持续感染、癌前病变和外生殖器病变方面表现出高效力。该试验中女性的一个子集已经被随访了五年，并且已经显示95.8％的抵抗持续感染或疾病的疫苗效力和100％的抵抗癌前和外部病变效力。需要进一步的后续研究来确定保护期，但研究已表明，10-14岁的青少年女性比15-24岁的女性对疫苗表现出更强的免疫应答，这表明更早期的疫苗接种可导致更长久的抗体持久性。其他最近的研究已表明，疫苗还提供对阴道和外阴癌的保护。根据AlanGuttmacher研究所，HPV疫苗“被广泛认为是近年来对妇女最伟大的卫生保健进展之一”。与qHPV疫苗不同，二价HPV疫苗仅由两种抗原组成：HPV16型和18型。对于其L1蛋白的合成，将基因克隆到杆状病毒表达载体中，并将所制造的载体感染到昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(HighFive)中，随后在无血清培养基中孵育两天；然后收获细胞。目前可用并经评估的HPV疫苗靶向预防HPV16型和18型的感染。HPV疫苗由通过重组技术产生的病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)制备，并且作为三次0.5ml肌内注射在六个月时期内施用。最近的结果表明，HPV疫苗是高度免疫原性的，在几乎所有接种疫苗的妇女中诱导高水平的血清抗体，并且在完全接种疫苗的妇女中赋予了针对HPV-16/18感染和因此相关的癌前宫颈病变的高度保护。已在33个国家的27,000名妇女中评估的四价(HPV6/11/16/18)疫苗已被证明可有效预防超过99％的持续感染。根据本专利技术的疫苗使用在早期HPV疫苗的开发中所使用的重组技术产生。通过使用重组技术获得所需蛋白质产物所涉及的主要步骤是将所需基因克隆到表达载体中，将基因表达在宿主细胞中(其可以称为表达系统)，对从插入基因获得的蛋白质产物进行纯化和表征。在每个上述步骤中通常使用的方法和组分在现有技术中广泛可用。所有这些提及的步骤对其中通常使用的组分具有一些限制和依赖性，例如表达载体、宿主细胞、核苷酸序列等。本领域技术人员必须分析重组技术中每种组分彼此的相容性。本专利技术提供了使用酵母作为表达系统的具有新的密码子优化基因的人乳头瘤病毒疫苗组合物，所述基因编码四种不同HPV类型(HPV16、HPV18、HPV6和HPV11)晚期HPV蛋白的HPV蛋白质。众所周知，毒株HPV16和HPV18的组合仅可以保护所有流行HPV毒株中的70％。因此，建议向疫苗中加入额外的抗原。由于世界上的区域之间存在流行病学差异，建议在世界上的相关区域中包括更多的血清型(对于印度是HPV33和HPV45)以提供更广泛的保护。已经描述了L2抗原与L1抗原一起将扩大保护的覆盖范围。发现根据本专利技术开发的人乳头瘤疫苗的体内血清转化应答远优于现有的参考产品。在本专利技术的现有领域中，在本领域中可以得知，用含有野生型HPV16L1基因的相同质粒转化的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(KM71菌株)不表达L1蛋白，表明需要对巴斯德毕赤酵母中的HPV16L1表达进行密码子优化。[Bazan等，ArchVirol.2009；154(10)；p1-16]本文描述了HPV16L1基因的密码子优化，并将其克隆到非整合载体中，并进一步用于转化感受态巴斯德毕赤酵母细胞。Bazan等公开了VLP似乎更规律和受限(45-50nm)。已知对于大规模生产，附加体载体(episomalvector)(非整合载体)不是有利的，因为转化的酵母在连续的有丝分裂后可能丢失这些载体，这是因为它们不整合到基因组中，因此可在不存在选择压力的情况下丢失。需要使密码子优化基因在选定的表达系统中获得表达。用于采用合适表达系统的任何抗原，这种技术在本领域中是为人熟知的。例如，N.HanumanthaRao等，Vaccine29(2011)7326-7334描述了在巴斯德毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒16型和18型的密码子优化的主要衣壳蛋白(L1)。此外，HanumanthaRao等公开了“ThepurifiedVLPsofHPV16andHPV18showedvariableparticlesizehavingameanofapproximately53nm.”(HPV16和HPV18的纯化VLP显示出平均约53nm的可变粒度)。其中，HPV基因在巴斯德毕赤酵母菌株GS115中克隆和表达。这些文章未提供与其VLP的免疫原性性质的即兴性(improvisation)有关的信息。增加的VLP免疫原性可以通过增加VLP的大小来实现，其允许更高数量的重复抗原呈递。最终，它将提供针对HPV抗原的更好的免疫应答。因此，本专利技术提供了针对不同血清型的HPVL1基因的密码子优化，其提供具有改善的免疫学质量的自组装VLP，以及最终针对HPV抗原的基本上更高的免疫原性应答。以相同的方式，可以产生HPVL2基因、HPV的早期抗原(E6和E7)的密码子优化以开发针对HPV抗原的疫苗。尽管选择优化基因以用于在特定宿主中表达所述基因是本领域中已知的技术，但是在优化中仍然存在许多可能的变化。密码子优化的方法不是通用的。因此，每个基因具有独特的密码子优化方法。我们在下文中已经提到几个专利申请，其作为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白的分离基因，其中所述基因选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.11 IN 2905/MUM/20141.编码人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白的分离基因，其中所述基因选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。2.包含编码人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白之基因的载体，其中所述基因选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及其组合。3.权利要求2所述的载体，其选自pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pAO815z。4.权利要求2所述的载体，其具有选自MTCC5969、MTCC5970、MTCC5971或MTCC5972的MTCC登录号。5.以权利要求1所述的基因转化的宿主细胞。6.包含权利要求2所述的载体的宿主细胞。7.权利要求5和6所述的宿主细胞，其是酵母细胞，优选巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。8.权利要求6所述的宿主细胞，其选自巴斯德毕赤酵母菌株X-33、GS115、KM71和SMD1168。9.通过使用权利要求1所述的基因获得的病毒样颗粒。10.权利要求9所述的病毒样颗粒，其直径在50-500nm，优选50-400nm，更优选100-400nm的范围内。11.人乳头瘤病毒疫苗，其包含至少一个来自权利要求1所述的编码衣壳蛋白的基因，其可引发针对HPV抗原的免疫应答。12.权利要求11所述的人乳头瘤疫苗，其还包含编码单一或不同血清型之L2、E6或E7抗原的基因。13.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈拉夫·古普塔，维维亚娜·詹尼诺，赖因哈德·格吕克，
申请(专利权)人：卡迪拉保健有限公司，
类型：发明
国别省市：印度,IN