具有抗肿瘤及免疫促进活性的银杏外种皮提取物及其有效部位的制备方法，属于中药制药技术领域。将银杏外种皮用热水煎煮２－３次，煎煮液分别过滤，向减压浓缩后的过滤液中加入组合盐溶液，过滤或离心去除水不溶物后用蒸馏水透析；将透析内液浓缩后，用乙醇沉淀，将沉淀物干燥，得银杏外种皮提取物；将银杏外种皮提取物溶于水后抽滤，将续滤液过大孔树脂柱，先用蒸馏水洗脱，待洗脱液糖试验为阴性时再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得银杏外种皮提取物有效部位。该提取物及其有效部位的多糖及蛋白质含量之和分别大于６０％及９０％，水溶性好，抗肿瘤及免疫促进活性强，可以制成固体剂型和液体剂型，制备工艺简便可行，适合工业化大生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有抗肿瘤及免疫促进活性的银杏外种皮提取物和提取物有效部位 的制备方法，属中药制药
技术介绍
银杏，为世界珍贵的“活化石”植物，中国为银杏之乡。银杏的果实又名白果，不但 营养丰富，而且其入药已有数千年历史，是举世闻名的药食同源珍品。银杏叶中含有黄酮和 萜内酯类等化合物，德国的Schwabe公司率先建立了银杏叶提取物(EGb)加工厂。经过国内 外近40年的持续研究，目前银杏叶制剂已广泛用于治疗心脑血管等疾病，这为银杏资源的 综合利用奠定了基础。银杏外种皮是白果最外层的肉质皮，俗称白果衣，约占其种实的3/4， 每到银杏收获的季节，产区就有大量的外种皮被当作废物而抛弃，不仅污染环境，而且造成 生物资源的极大浪费。如何将臭烘烘的外种皮变废为宝，更好地综合开发利用银杏资源，我 们课题组围绕这个问题已经进行了十几年的研究，曾从外种皮中提取多糖类化合物并进行 了一系列基础研究及临床初步试用，取得了一系列研究成果。但采用以往的工艺制备的多 糖类化合物虽然也具有一定的生物活性，但由于其水溶性不太理想，只能制成固体剂型，限 制了一些癌症病种的临床应用，又未分离其有效部位并进一步进行相关研究，从而影响了 新药研发及申报的进程。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述现有技术存在的不足，第一个目的是提供一种具有抗肿瘤及 免疫促进活性的银杏外种皮提取物的制备方法，第二个目的在于提供一种具有抗肿瘤及免 疫促进活性的银杏外种皮提取物有效部位的制备方法。本专利技术的第一个目的是通过以下技术方案实现的，具有抗肿瘤及免疫促进活性的 银杏外种皮提取物的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将银杏外种皮采用90_99°C热水煎煮，每次l_2h，共煎煮2_3次，料液比为 1 6-12 (V/W)，将煎煮液分别过滤并合并过滤液；(2)将过滤液减压浓缩后，加入浓度为25% (W/V)的由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁按 重量比为8 1 1组合而成的盐溶液，使浓缩过滤液的pH值为7. 0-7. 4，充分搅拌后静置 2_4h，再次过滤或按800-1200转/分离心3-5分钟去除水不溶物；(3)将去除了水不溶物的浓缩过滤液采用截留值为7000-10000的透析膜用 50-100倍体积的蒸馏水透析12-24h，将透析内液减压浓缩后，向浓缩的透析内液中加入乙 醇，使乙醇终浓度为60-85% (V/V)，静置沉淀；(4)将沉淀物用90-98 %的乙醇洗涤2_4次后真空干燥或冷冻干燥，得到银杏外种 皮提取物。所述的步骤(2)中的过滤液减压浓缩至密度为1. 02-1. 08 ；4所述的步骤(3)中的透析内液减压浓缩至密度为1. 09-1. 15 ；所述的步骤(4)中的银杏外种皮提取物在(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于 水，其多糖含量与蛋白质含量之和大于60%。本专利技术的第二个目的是通过以下技术方案实现的，具有抗肿瘤及免疫促进活性的 银杏外种皮提取物有效部位的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将银杏外种皮采用90-99°C热水煎煮，每次l_2h，共煎煮2-3次，料液比为 1 6-12 (V/W)，将煎煮液分别过滤并合并，将过滤液减压浓缩至密度为1.02-1. 08后，加 入浓度为25% (W/V)的由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁按重量比为8 1 1组合而成的盐溶 液，使浓缩过滤液的PH值为7. 0-7. 4，充分搅拌后静置2-4h，再次过滤或按800-1200转/ 分离心3-5分钟去除水不溶物，将去除了水不溶物的浓缩过滤液采用截留值为7000-10000 的透析膜用50-100倍体积的蒸馏水透析12-24h，将透析内液减压浓缩至密度为1. 09-1. 15 后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60-85% (V/V)，静置沉淀，将沉淀物用 90-98%乙醇洗涤2-4次后真空干燥或冷冻干燥，得银杏外种皮提取物；(2)将银杏外种皮提取物溶于水，使水溶液的浓度为(W/V)；(3)将(W/V)银杏外种皮提取物水溶液抽滤，将续滤液过大孔树脂柱；(4)先用蒸馏水洗脱，待洗脱液糖试验为阴性时，用IOBV的65-95%的乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到银杏外种皮提取物有效部位。所述的步骤(3)中所用大孔吸附树脂层析柱的高度与直径之比为20 1 ；所述的步骤(4)中所用的乙醇洗脱时流速为l_2BV/h ；所述的步骤(4)中所得到的银杏外种皮提取物有效部位在2% (W/V)浓度下肉眼 观察完全溶解于水，其多糖含量与蛋白质含量之和大于90%。本专利技术科学、合理、简单，在乙醇沉淀前加入含多种酸根的组合盐溶液有利于除去 银杏外种皮提取物中的水不溶物并进行有效部位分离，将银杏外种皮提取物水溶液过弱极 性大孔吸附树脂并用不同极性的无毒溶剂洗脱，使分离得的有效部位含量高，安全性好。该 方法制得的银杏外种皮提取物中多糖含量与蛋白质含量之和大于60%，符合国家相关质量 标准要求，制得的银杏外种皮提取物有效部位中多糖含量与蛋白质含量之和大于90%，使 抗肿瘤及促进免疫作用效价强度增高，也有利于对其进一步进行化学分析及抗肿瘤作用机 制研究。该方法制得的具有抗肿瘤及免疫促进活性的银杏外种皮提取物及其有效部位水溶 性好，既可以制成固体剂型，也可以制成液体剂型，制备工艺简便可行，适合工业化大生产。1、肽多糖(多糖含量+蛋白质含量)含量的测定采用苯酚硫酸法测多糖含量精密称取无水葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配成 lmg/ml的葡萄糖标准液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30μ g/ml、60y g/ml、 90 μ g/ml,120 μ g/ml,150 μ g/ml, 180 μ g/ml 的葡萄糖标准溶液 0. 5ml 于 6 支 IOml 具塞 试管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml浓硫酸，混合均勻，沸水浴 15min,冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，对葡萄糖溶液浓度和吸光 度进行线性回归，建立回归方程。取银杏外种皮提取物(GBE)及其有效部位(GBEE)供试品 溶液0. 5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出多糖含量。采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量精密称取牛血清白蛋白标准品适量，用蒸馏水 配成100 μ g/ml的蛋白标准溶液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20 μ g/ml、540 μ g/ml、60 μ g/ml、80 μ g/mlUOO μ g/ml蛋白标准溶液0. 5ml分别于5支IOml具塞试管， 再加入2. 5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇勻后，放置5 lOmin，待其充分反应后，用紫外分 光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立 回归方程。取GBE及GBEE供试品溶液0. 5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算 出蛋白质含量。采用红外光谱分析仪进行定性分析。结果显示GBE及GBEE皆含酰胺键，提示皆为 肽多糖。肽多糖含量％=(多糖含量+蛋白质含量)％GBE及GBEE肽多糖含量结果见表1。表IGBE及GBEE肽多糖含量 表1结果显示，GBE的肽多糖含量大于60%，GBEE肽多糖含量大于90%。2、抗肿瘤活性测定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抗肿瘤及免疫促进活性的银杏外种皮提取物的制备方法，其特征是包括以下步骤：（１）将银杏外种皮采用９０－９９℃热水煎煮，每次１－２ｈ，共煎煮２－３次，料液比为１∶６－１２（Ｖ／Ｗ），将煎煮液分别过滤并合并过滤液；（２）将过滤液减压浓缩后，加入浓度为２５％（Ｗ／Ｖ）的由氯化钠、碳酸钠及硫酸镁按重量比为８∶１∶１组合而成的盐溶液，使浓缩过滤液的ｐＨ值为７．０－７．４，充分搅拌后静置２－４ｈ，再次过滤或８００－１２００转／分离心３－５分钟去除水不溶物；（３）将去除了水不溶物的浓缩过滤液采用截留值为７０００－１００００的透析膜用５０－１００倍体积的蒸馏水透析１２－２４ｈ，将透析内液减压浓缩后，向浓缩的透析内液中加入乙醇，使乙醇终浓度为６０－８５％（Ｖ／Ｖ），静置沉淀；（４）将沉淀物用９０－９８％的乙醇洗涤２－４次后真空干燥或冷冻干燥，得到银杏外种皮提取物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许爱华，陈华圣，吴倩，杨茜，李俊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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