【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种多基因缺失的肠炎沙门菌、其构建方法及应用。
技术介绍
1、沙门菌病是由沙门菌引起动物和人类急性和慢性疾病的总称。人类感染沙门菌主要表现为恶心、呕吐、腹泻等症状；动物感染沙门菌后，临床上则多表现为败血症和肠炎，也可使怀孕母畜发生流产(焦新安.沙门菌病[m].中国农业出版社,2015.)。沙门菌病作为重要的人兽共患病，在全球范围都是重要的动物疫病和重大的公共卫生问题，该病不仅给畜禽养殖业带来重大经济损失，而且会对人类健康构成严重的威胁。多年来，针对不同的沙门菌病，全球很多国家先后采用了生物安全、免疫预防、抗生素防治等措施预防和控制沙门菌病。虽然该病的流行在一定程度上得到了控制，但由于各种原因，该病的防控仍然是一项长期而艰巨的任务。
2、沙门菌是一种革兰氏阴性菌，宿主谱广泛，且危害严重。在众多的沙门菌血清型中，以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主的非伤寒沙门菌(nts)能够通过各种畜禽产品危害人类健康(balasubramanian r,im j,lee js,et al.the global burden andepidemiology of invasive non-typhoidal salmonella infections[j].hum vaccinimmunother,2019,15:1421-1426.)。肠炎沙门菌能够引起成年鸡隐性感染，并通过粪便向外界环境排菌，造成环境污染，同时也导致病原菌难以净化；受肠炎沙门菌感染的雏鸡则表现为严重的全身性感染和高死亡率(crump ja,sj
3、目前，由于我国之前预防沙门菌的防控主要依赖于抗生素，但随着抗生素的大量使用，会出现多重耐药甚至全耐药的沙门菌及国外疫苗的技术封锁。我国自主的疫苗研制是免疫预防和治疗沙门菌的主要途径，通过接种疫苗可以减少沙门菌在机体的定殖和入侵，并减少粪便排菌和环境污染来降低公共卫生风险。
4、沙门菌疫苗主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗以及减毒活疫苗。其中与灭活疫苗和亚单位疫苗相比，减毒活疫苗免疫原性好，除能够诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫外，还可作为疫苗载体，是预防沙门菌的重要手段(马湘海,尹佳彤,汪珏楚,等.禽沙门菌疫苗研究进展[j].畜禽业,2021,32:8-9.)。
5、有研究表明，trme基因缺失后沙门菌高度减毒，并且该缺失株免疫小鼠后可诱发高水平的igg1和igg2a，保护小鼠免受高致死剂量的野生型沙门菌攻击(dc shippy,nmeakley,ct lauhon,et al.virulence characteristics of salmonella followingdeletion of genes encoding the trna modification enzymes gida and mnme[j].microb pathog,2013,57:1-9.)。因此，trme基因有希望成为减毒活疫苗或广谱抗菌药物的靶点。
6、有研究发现purl基因的缺失使lps结构发生改变并且该基因可能与细菌毒力和宿主全身性感染有关(hn tuntufye,s lealer,ps gwakisa,et al.identification ofavian pathogenic escherichia coli genes that are induced in vivo duringinfection in chickens[j].appl environ microbiol,2012,78(9):3343-3351.)。cepas等发现purl基因的突变导致大肠杆菌的生物膜缺损，证明purl是大肠杆菌生物膜形成的关键基因，同时认为其是一个潜在的抗菌靶点(v cepas,v ballén,y gabasa,etal.transposon insertion in the purl gene induces biofilm depletion inescherichia coli atcc 25922[j].pathogens,2020,9(9):774.)。
7、spic基因被认为是影响沙门菌毒力的重要基因，其编码的效应蛋白作用与宿主膜泡运输相关。spic蛋白对沙门菌在吞噬细胞中的生存是必需的，其被t3ss2分泌到宿主细胞的胞质溶胶中，与宿主蛋白相互作用，干扰宿主细胞的运输并抑制吞噬细胞与溶酶体之间的融合(geng sz,qian s,pan zm,et al.preparation of monoclonal antibodiesagainst spic protein secreted by t3ss-2 of salmonella spp[j].monoclonalantibodies in immunodiagnosis&immunotherapy,2015,34(6):432-435.)。rfbe基因都是lps相关基因，能参与脂多糖的生物合成。rfbe基因的缺失都会导致lps的完整性遭到破坏，细菌表型从光滑型变为粗糙型。研究显示，spic基因是沙门菌重要的毒力基因，且rfbe基因都是lps相关基因，也与沙门菌的毒力相关；sifa是沙门菌维持scv膜完整性的重要spi2效应蛋白，缺失sifa的沙门菌可以增强炎性小体的活化(宋佩烜,胡桂秋,秦晓霞,等.sifa基因缺失沙门菌增强巨噬细胞炎性体活化研究[j].动物医学进展,2016,37(05):1-4.)。
8、因此，选择这些基因的原因如下：第一点，这些基因的缺失都可能导致沙门菌的毒力下降。第二点，经过多基因的筛选组合及无痕敲除的构建方式，其构建的突变株会显著影响毒力。第三点，五基因的疫苗突变株，在鸡体内进行基因回复的能力减弱，这些都为研发减毒疫苗提供了可能。
9、国内常采用药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因。
3.根据权利要求1或2所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述spiC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述purL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sifA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述trmE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述rfbE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1或2所述的多基因缺失的肠炎沙门菌菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：将肠炎沙门菌Z11的spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上敲除。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述敲除基因的方法采用同源重组的
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述敲除基因的方法采用自杀质粒的方法敲除基因。
7.权利要求1或2所述的一种多基因缺失的肠炎沙门菌在制备肠炎沙门菌灭活疫苗中的应用。
8.一种肠炎沙门菌灭活疫苗，其特征在于，含有权利要求1或2所述的任一多基因缺失的肠炎沙门菌。
...【技术特征摘要】
1.一种多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spic基因、purl基因、sifa基因、trme基因、rfbe基因中的两种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spic基因、purl基因、sifa基因、trme基因、rfbe基因。
3.根据权利要求1或2所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述spic基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述purl基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述sifa基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述trme基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述rfbe基因的核苷酸序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，廖宗杰，黄鹏，耿士忠，孙林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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