人淋巴细胞抑制性受体基因CTLA-4和PD-1的6条序列及应用制造技术

技术编号:7795705 阅读:385 留言:0更新日期:2012-09-23 22:04
本发明专利技术涉及生物制药领域。将人淋巴细胞抑制性受体基因CTLA-4(Cytotoxic?T?lymphocyte?antigen?4,细胞毒性T淋巴细胞抗原4)和PD-1(Programmed?cell?death-1,程序性死亡受体1)的6条核酸序列,应用于核酸类药物设计,以研发药物,治疗免疫疾病中消除免疫抑制、调节免疫、和消除肿瘤免疫逃逸进行肿瘤治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药领域,6个基因靶点序列具有能特异结合核酸药物的功能,对核酸类药物先导物的设计在肿瘤治疗、和在免疫相关疾病调节治疗中基因干预应用。
技术介绍
淋巴细胞増殖失能直接导致免疫低下,而CTLA-4抑制性受体表达是増殖失能的直接原因。因此降低CTLA-4的表达可提高T免疫细胞増殖因而提高细胞免疫功能。淋巴细胞凋亡也导致免疫低下,τ淋巴细胞ro-i的表达引起τ淋巴细胞凋亡造成免疫失能,引起感染和肿瘤细胞发生。因此抑制T淋巴细胞的ro-i,可以强化免疫细胞识别 杀灭新生感染原和肿瘤细胞,保持机体正常。因此,以CTLA-4和Η)-1两个抑制性受体为靶进行药物研发,对免疫调节和肿瘤治疗具有很好的临床治疗意义和前景。
技术实现思路
本专利技术采用实验室专用技术(在申请专利),从人CTLA-4和TO-Ι两个基因筛选出6个序列,这些序列经过验证能高效结合寡核苷酸药物,可以用作药物研发设计候选结构应用。附图说明图I :靶点1-3的结合能力图(#1,#2,#3分别表示1,2,3靶点处的切割反应)图2 :靶点1-3的细胞内作用结果(流式细胞仪分析CTLA-4受体表达)图3 :4_6号靶点(即TO-Ι靶点1-3)的结合能力图(AS1#,2#, 3#分别表示I3D-I的1,2,3靶点切割效果,AS对照为非靶点处的切割效果)图4 =PD-I靶点1-3的细胞内作用结果(RT-PCR分析H)_l受体表达)(1-4分别表示I3D-I未处理细胞mRNA的RT PCR扩增的分别扩增35、33、31、28循环产物,5表示TO-Ι经非靶点对照表达Ribozyme慢病毒处理细胞mRNA的RT PCR扩增25循环的产物,6-8分别表示I3D-I经靶点1、2、3构建表达Ribozyme慢病毒处理细胞mRNA的RTPCR扩增25循环的产物。6-8表明与5号对照组相比靶点均有效抑制并降低了基因的表达,3号抑制效果最強,2号其次,I号尚可。图中M表示DNA分子量标准,最小带型为IOOObp)具体实施例方式本专利技术实施的实验步骤及结果(结合附图阐述)I. 1-3号靶点对CTLA-4 mRNA作用及性能I、1-3靶点对CTLA-4基因mRNA分子的作用经过液相固定mRNA和文库杂交筛选,经过设计相关反义核酸结合RNase H切割验证,与对照反义核酸相比3个靶点的反义核酸均能诱导RNase H对基因mRNA发生切割;同时经过设计DNAzyme直接切割验证,结果对照DNAzyme相比3个靶点的DNAzyme均能对基因mRNA发生切割。因此获得CTLA-4基因3条靶点序列为有效靶点(如图I)。2、祀点1-3设计的Ribozyme通过制备慢病毒表达质粒,生产包装了质粒的病毒,分别感染CTLL-2细胞,对照组和1,2,3号慢病毒表达Ribozyme对荧光素标记CTLA-4抗体标记细胞计数,结果1,2,3靶点在作用48hr细胞CTLA-4表达水平均有效降低,分别达对照组的38%,33%和36%水平。因此获得1-3靶点序列为有效(如图2)。2. 4-6号靶点对ro-1 mRNA作用及性能3、4-6靶点对基因TO-Ι的mRNA分子作用经过液相固定mRNA和文库杂交筛选,经过设计相关反义核酸结合RNase H切割验证,与对照反义核酸相比3个靶点的反义核酸均能诱导RNase H对基因mRNA发生切割。因此获得I3D-I基因3条靶点序列为有效靶点 (如图3)。4、4-6革巴点(即F1D-I革巴点1-3)设计的Ribozyme通过制备慢病毒表达质粒,生产包装了质粒的病毒,分别在24孔培养板中感染Jurket淋巴细胞(每孔细胞数为30000个),培养72小时,收集细胞、提取总RNA,用反转录PCR鉴定TO-Ι的表达,对照组和I3D-I的1,2,3号慢病毒表达Ribozyme对Jurket细胞TO-I表达水平均有效降低。因此获得4_6靶点序列为有效(如图4)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人CTLA-4 mRNA 从起始 AUG 处算起的 184_213nt 处、261_290nt 处、和 349_378nt 处序列,即(1)TTCACCATCACACAACACTGATGAGGTCCGGGT(2)CACGACATTCACAGAGAAGAATACAGTGGGCTT(3)ATCCAAGGACTGAGAGCTGTTGACACGGGACTG 人PD-I基因mRNA从起始AUG处算起的208_240nt处、275_305nt处、和248_280nt处序列。(4)GGCCAGCTTGTCCGTCTGGTTGCTGGGGCTCAT(5)CGTTGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员:毛建平方静周颖崔玉芳马琼谷庆阳
申请(专利权)人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1