本发明专利技术涉及通过在低温下在培养系统中培养编码期望融合体的ＤＮＡ转化的宿主，从而使错折叠或错桥接蛋白质形式最小化的对于其配体具有高亲和性的蛋白质－免疫球蛋白融合体形式的高产率表达的方法。所述宿主细胞可以是转化的哺乳动物，昆虫，酵母或细菌细胞。所述蛋白质－免疫球蛋白融合体可以包括ＴＮＦ或ＴＮＦ－受体家族的一员，例如淋巴毒素－β或淋巴毒素－β受体。本发明专利技术还涉及含有所述蛋白质－免疫球蛋白融合体的药物组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
高水平表达活性淋巴毒素-(3受体免疫球蛋白嵌合蛋白 的方法以及它们的纯化方法本申请是申请日为1999年12月16日、申请号为99815695. 7、专利技术 名称为"高水平表达活性淋巴毒素-p受体免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以 及它们的纯化方法，，的专利技术专利申请的分案申请。背景TNF家族由称之为TNF家族配体和TNF家族受体的配体和它们的特异 受体对组成(Bazzoni和Beutler， 1996; Aggarwal和Natarajan, 1996)。 象TNF这样的配体一M现是细胞表面上的膜结合形式，或者在某些情况 下它们从细胞表面选择性裂解并分泌出来。配体与特异受体结合并且这 种结合作用使得两个或多个受体聚集。这些受体的胞内区域可以以某种 方式感觉这种变化并且将该信息通过信号转导机制发送给细胞内。免疫 系统以及可能其它非免疫系统的调节中涉及该家族。所述调节经常以"主 开关"水平，使得TNF家族信号可以导致大量的继发TNF最佳代表的作 用。TNF可以引发生物体对外来侵袭的一般保护性炎症反应，其涉及细胞 运输中涉及的附着分子的改变的表现，驱动特异细胞1特异区室的趋化 因子产生和各种效应细胞的引导。因此，这些途径的调节具有临床潜力。TNF受体家族是一般由胞外结构域，跨膜结构域和胞内信号结构域组 成的相关蛋白质的集合。胞外结构域由紧密二硫键结构域的2 — 6个拷贝 构成，并且在半胱氨酸的独特排列的基础上被识别(Banner等，1993 )。 各个受体结合相应的配体，但是一个配体可以结合几个受体。在某些情况 下，天然存在没有跨膜结构域和/或胞内结构域的可溶形式的受体这一点 是清楚的，自然中，这些受体的平截本可以具有直接的生物调节作用。 osteoprotegerin系统提供该方法的实施例。Osteoprotegerin是一种分 泌的TNF家族受体，其阻断引发破骨细胞活化的由RANK-L(也称之为 TRANCE)和/或TRAIL至受体的信号。通过阻断这些受体，大多数可能的 RANK受体,骨吸收受到阻碍并且骨质增加(Bucay等，1998)。很清楚，病毒利 用了该方法来在它们的宿主生物体中抑制TNF活性(Smith等,1994)。这些受体可以对很多作用发出信号，包括细胞分化，细胞死亡或细胞成活信号，细胞死亡信号在Fas和TNF受体的情况下经常通过与caspase蛋白 水解酶的级联相对直接连接而引发。TNF受体是解释生物学途径的有力工具，因为它们容易转化为具有长 血清半寿期的免疫球蛋白融合蛋白。二聚体可溶受体形式可以是天然分 泌的或表面结合的配体介导作用的抑制剂。通过与这些配体结合，这些融 合蛋白阻止该配体与细胞相关的受体相互作用并且抑制相关的信号。这 些受体-Ig融合蛋白在实验意义上是有用的，并且也成功地在临床上使用， 例如TNF-R-Ig已经被用来治疗肠炎，类风湿性关节炎和伴随OKT3给药的 急性临床综合症(Eason等，1996 ;Feldmann等，1997; van Dullemen 等，1995).由TNF家族受体传递信号的很多作用的操作可以在治疗以免 疫为基础的疾病以及宽范闺的具有由于涉及免疫系统的病理后遗症的人 疾病中应用。例如最近描迷的一种可溶形式的受体，osteoprotegerin, 已经证明阻断骨质的损失(Si咖onet等，1997)。闳此，TNF家族受体传递 信号控制的作用比必要限制免疫系统调节.针对受体的抗体可以阻断配 体结合并且因此也具有临床用途。这样的抗体寿命经常非常长，并且具有 超过可溶性受体-Ig融合蛋白的优点，可溶性受体-Ig融合蛋白在血液中 具有更短的半寿期'抑制受体介导的途径代表这些受体的最輝煌的治疗应用，最初是TNF 受体的激活表现出有临床前景(Aggarwal和Natarajan, 1996)。 TOF受体 的激活可以引发把细胞中细胞死亡，并且因此对肿瘤的应用还是具有吸引 力的(Eggermont等，1996).通过给与受体，即自然途径，或者通过给与可 以与所述受体交联的抗体,都可以激活该受体.抗体对于治疗例如癌症， 可能是有利的，罔为抗体与配体相反可以在血液中保持长时间，而配体在 血液中具有短的寿命.拮抗抗体是治疗癌症的有力武器，西为在肿瘤中受 体可以更具有选择性地^达，或者它们在肿瘤中只对细胞死亡或分化发 出信号，同样，通过TNF家族受体介导很多正免疫学作用，例如宿主炎症反 应,抗体产生等，因此拮抗剂抗体在其它非癌症应用中具有有益效果。反常规地， 一个途径的抑制在治疗肿瘤中也可以具有临床利益.例如，一些肿瘤表达Fas配体，并且该表达可以导致Fas阳性淋巴细胞的死亡， 这样有利于肿瘤避开免疫系统的能力。在这种情况下，Fas系统的抑制然 后使得免疫系统以现在有可能评价的其它途径与肺瘤反应(Green和 Ware, 1997)。该受体家族中的一员，淋巴毒素-P受体(LTPR)结合表面淋巴毒素 (LT)，而表面淋巴毒素由淋巴毒素-a和P链的三聚体复合物构成(Crowe 等，1994)。在外周免疫系统的发育和成熟免疫系统中淋巴结和脾中作用 的调节中涉及这种受体-配体对(Ware等，1995;Mackay等，1997;Rennert 等，1996; Rennert等，1997;Clmplin和Fu, 19卵)'LTpR和IgG之间可以 形成淋巴毒素-p受体-免疫球蛋白融合蛋白(LTPR-Ig),其阻断表面LT配 体和受体之间传递信号，并且对小结树突细胞的功能状态有影响Ofeckay 和Browning1998)。这种阻断在啮齿类动物模型中还能导致减少的自身免 疫疾病(Mackay等，1998， 1995年7月21日申请的U. S. S. N. 08/505606和 1996年10月26曰申请的U. S. S. N. 60/029060)。该受体家族的笫二个成 员称之为疱奢病毒^V介体的HVEM,其结合称之为Light的配体Ofeuri 等，1998)以及herteromeric LT配体。目前不知道该受体的功能，但是 HVEM-Ig融合蛋白可以用于免疫疾病的治疗，并且已经证明该构建体体外 影响免疫功能测定(Harrop, J. A.，等，1998)。尽管如上所述TNF家族成员具有临床上的进步，但是仍然有对于获得 期望产率的适合在临床条件下使用的受体Ig融M的方法的需要。例如， 当在猴COS细胞或者在中国仓鼠卵巢细胞中表达时，LTPR-Ig蛋白可以变 成两种形式。 一种形式以高亲和性结合配体而另一种则不是这样。闳此， 有对于产生更高产率的以高亲和性结合的形式同时使较低亲和性形式的 存在最小化的方法的需要，专利技术概迷本专利技术涉及通过在低温下在培养系统中培养编码期望的融合体的DNA 转化的宿主从而使错折叠或错桥接蛋白形式的量最小化的具有结合其配 体的高亲和性的蛋白质-Ig融合体形式，本文称为"活性"形式的高产率表达方法。在各种实施方案中，本专利技术涉及通过在大约27"至大约35TC 的温度下培养转化宿主而在哺乳动物表达系统中表达高产率的方法。优 选地，在大约27t:至大约32*C的温度下培养哺乳动物宿主。在其它实施方案中，本专利技术涉及在低温下在酵母表达系统中通过培养 转化宿主表达高产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达高产率活性蛋白质－Ｉｇ融合体的方法，包括在一个具有大约２７℃至大约３５℃的低温的培养系统中培养用编码期望的蛋白质－Ｉｇ融合体的ＤＮＡ转化的宿主。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：J布朗宁，K米阿特科斯凯，W枚伊尔，
申请(专利权)人：拜奥根IDEC马萨诸塞公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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