CAR修饰的NK细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种CAR修饰的NK细胞的制备方法，构建嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR‑NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR‑NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16。

【技术实现步骤摘要】
CAR修饰的NK细胞的制备方法
本专利技术涉及引入外来遗传物质修饰细胞
，特别涉及一种CAR修饰的NK细胞的制备方法。
技术介绍
自然杀伤(NaturalKiller，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞（包括NK细胞）来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor，缩写CAR）修饰的免疫细胞使用遗传生物工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。其主要以T-细胞为载体，但CAR-T细胞存在细胞因子风暴，靶向/脱靶毒性和神经毒性等问题.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（Antibody-DependentCell-MediatedCytotoxicity，缩写ADCC）是抗体首先结合到癌靶细胞上，然后抗体的另一端与免疫效应细胞结合，促进效应细胞杀死被抗体结合的癌靶细胞。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种CAR修饰的NK细胞的制备方法，使自然杀伤细胞同时具有嵌合抗原受体修饰，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。本专利技术所采取的技术方案是：CAR修饰的NK细胞的制备方法，构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR-NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16，阳性率高于80％以上，激活性受体阳性率超过80％以上，而抑制性受体阳性率低于10％以下。所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域和CD3ζ胞内信号区的基因片段；所述两个共刺激分子为CD28和CD137。所述NK细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。本专利技术的有益效果是：1）NK细胞是先天性细胞，非特异性免疫系统的重要组成部分，具有强大的肿瘤细胞溶解活性，不需要提前致敏或HLA配型，克服了某些肿瘤逃逸机制；2）现有的CAR-T细胞只依靠CAR来识别和杀死肿瘤细胞。NK细胞与CAR-T细胞不同，可以同时通过多种NK细胞自身表达的激活型受体激发细胞毒性作用。也可以敲除NK细胞内抑制性信号通路，或通过ADCC作用，来加强NK细胞杀死肿瘤细胞的作用；3）现有以T细胞作为CAR基因载体，其异体应用时会产生移植物抗宿主病(GVHD）。由于NK细胞作用是非MHC-限制性，使用上没有必要与病人个体的组织相容性复合物相匹配，也就是NK细胞可用于异体病人细胞治疗，有可能建立从健康（异体）供体采集扩增的off-the-shelf（“拿来即用”）的细胞药品，具有广泛的临床应用价值；4)NK细胞较易浸润实体瘤。NK细胞在体内可通过其独特的作用机理，如与树突状细胞的相互作用及大量释放一些重要的细胞因子，来修改实体瘤的免疫环境；5）由于NK细胞在体内生存较为短暂的性质，临床应用时不用象CAR-T细胞那样添加自杀基因；6）NK细胞可利用其专门的IgG低亲和力受体CD16与抗体结合，是体内发挥ADCC作用的主要效应细胞。有实验数据证实西妥昔单抗的治疗作用主要是由于NK细胞的ADCC。因此，刺激NK细胞的先天免疫应答，增强西妥昔单抗的ADCC作用。在西妥昔单抗使用上增强NK细胞的作用也能增强获得性免疫（也称特异性免疫或适应性免疫反应）反应，因为NK细胞与树突状细胞的“对话”，可导致西妥昔单抗治疗中的肿瘤抗原特异性T细胞应答。具体实施方式本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。CAR修饰的NK细胞的制备方法，构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR-NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16，阳性率高于80％以上，激活性受体阳性率超过80％以上，而抑制性受体阳性率低于10％以下。其中，所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域和CD3ζ胞内信号区的基因片段；所述两个共刺激分子为CD28和CD137。进一步，所述NK细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
CAR修饰的NK细胞的制备方法，其特征在于，构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR‑NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR‑NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16，阳性率高于80％以上，激活性受体阳性率超过80％以上，而抑制性受体阳性率低于10％以下。

【技术特征摘要】
1.CAR修饰的NK细胞的制备方法，其特征在于，构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员的嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR-NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR-NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛海燕，
申请(专利权)人：广东康普泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44