一种柑橘的绿色组织特异启动子制造技术

一种柑橘的绿色组织特异启动子，其具有SEQIDNO.1所示的序列。使用本发明专利技术之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种柑橘緑色组织特异启动子，尤其涉及绿色组织特异表达。
技术介绍
在转基因研究中，启动子是决定外源基因在转基因植株表达的关键性元件。目前，转基因研究中主要使用组成型启动子。组成型启动子驱动外源基因持续恒定在各个组织表达，造成植株物质和能量的浪费，产生了大量的异源蛋白质或代谢产物并在植株体内积累，打破了植株原有的代谢平衡；在可食用部分表达外源基因，还会带来转基因食品安全问题
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种柑橘的緑色组织特异启动子，使用该柑橘緑色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剤、抗虫等外源基因只在茎、叶等緑色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。本专利技术之柑橘的绿色组织特异启动子的序列为SEQ ID NO. I AAACiC TTO ATCjAC CjAC TATAATTftTTTC ATOATC TTC C G C C AAt CjJC C CjC ATC CjT C AU,CiC3TTC AimCTTTTC ATTTT6TC TATC AACiTC A6AC TAM ATC A C C.TC ITTOATTC A AAC AA ACiA A AA C A TC AC 6 TC ΠΤΑΑ ATA TC IATAAATG C AAATC A C T6C AG AsTTTICTO TC TTC3TTTC3 TOTTTATC Ti3CCCiM 6 |jAT4AC 6ΑΤΑ)Α€ΑΑΑ€ΑΑ TOTCCjAA AATTC A6 TTT AAAAAC WC AAWAATC C ATC AATATTTC C A ATTTTA AGTC Ci TfCiAAAAC TOTTTTC ACC Af3Ai3CiAAAAACAAAAGAAAA AACiAOI C GTTAAAAAmTCtiGAC CATCjC AAAC GTG6C'jI6I I 11 IAATTC ΑΛ6ATAIATCAATCTA 66AA61: AWATC TC WAC A AciAWTTC AAT6A6TI T6 AAT6C AATC C AWATAC ATAC 6JCsmAi AC CC4C ACT66TTC CATOTC AATAAAACSAAICTCAAfjAf3C C Tfj G TiiG A CTAihA 6AC TGC C AC C TC AC AT6AAAAATC AAA C C C AAAATC TTC AC3C TTC C AAHiAAATT A<3 Α6ΑΑ ΤΑ§ΑΤφ C AC AAifiAT^CjAA AC C TCjA CTC AAAAA AC AmTATAATAAAI C CAC C AAToTAC AACjTTC CAATO AC CTTtTC AAC ACTC CjAA C AC TACi ACjC TC ACCA AC AA C TC T6ATC ATTG+TA A A 所述启动子序列包含5个与组织特异表达相关的顺势作用元件GATA-box ;GATA-box使用方框标注，TATA-box使用下划线标注，CAAT-box使用波浪线标注。序列全长708bp。该启动子在控制组织特异性表达的元件GATA-box以及其他顺势作用元件的调控下驱动外源基因在緑色组织特异表达，在其他组织不表达。使用本专利技术之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剤、抗虫等外源基因只在茎叶等緑色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。 附图说明图I为本专利技术带有柑橘緑色组织特异启动子序列表达载体的构建示意 图2为本专利技术实施例PBI121表达载体示意图。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术作进ー步详细说明。本实施例利用SEQ ID NO. I所示的绿色组织特异启动子构建表达载体，以PBI121质粒(带有组成型启动子35S)为对照，农杆菌介导法分别转化番茄。 本实施例具体包括以下步骤 (1)表达载体的构建根据SEQID NO. I和PBI 121载体序列设计带有酶切位点和保护性碱基的特异引物F :5 ' - TAAAGCTTTCATGACGACG -3 '和R :5 '-CGTCTAGATTTACAATGATCAGAG -3'，酶切位点分别为Hind III和Xba I;以糖橙基因组DN A为模板，P C R扩增得到SEQ ID NO. 1，将P C R产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收产物连接到PGM-T easy载体，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证；分别将获得的正确阳性克隆菌和含PBI121质粒的大肠杆菌接种到含有50mg/lAmp和50mg/lkan的LB液体培养基，37°C，180r/min,培养12h，分别提取质粒；将获得的两种质粒分别利用Hind III和Xba I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测，含有绿色组织启动子序列的质粒回收小片段，PBI121质粒回收大片段。利用D N A连接酶将上述两个片段连接，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证； (2)农杆菌介导法转化番茄制备农杆菌EHA105感受态，从YEB平板上挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于含利福平25 mg/1的YEB液体培养基中，28で，220 rpm摇菌12h;取上述培养物O. 5 ml加入到50 ml含利福平25 mg/1的YEB液体培养基中，28で，280 rpm 摇4 h，使其0D_达到O. 5。将菌液冰浴30 min，然后在4で、6 000 rpm离心10 min，收集菌体，加入10 ml预冷的O. 15 mol/1 NaCl悬浮细胞。4 °C,6 000 rpm离心10 min ;弃上清，加I ml预冷的20 mmol/1 CaCl2重悬细胞，分装于离心管中，一 70で保存备用；取构建的表达载体质粒和PBI 121质粒各I μ 1(0. 5 I μ g)分别加入到100 μ I的EHA105感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min;液氮中速冻I min，37で温育3 5 min，融化细胞，カロ入Iml含50 mg/1 Kan的YEB液体培养基，28 V，125 rpm摇2 3 h ;收集菌体涂布于含50 mg/1 Kan的YEB平板28で培养2天；挑取单菌落，PCR鉴定，将阳性克隆保存于_70°C 备用；无菌苗的培养，番茄种子用75%酒精消毒30seC，接着在10%的次氯酸钠溶液消毒30min，期间每隔5min摇动ー下，灭菌蒸馏水冲洗5次，接种于1/2 MS培养基；25°C黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25°C、16h光照/8h黑暗，光照强度1800Ix ;外植体准备和农杆菌培养，种子发芽后7d，将无菌苗的子叶和下胚轴用刀切下(叶带有一小段叶柄，下胚轴约2cm)，置入预培养基中培养Id ;取转入表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘的緑色组织特异启动子，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓子牛，陶坚，龙桂友，李荣华，戴素明，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：