流感A病毒变体制造技术

本发明专利技术涉及流感A病毒变体，特别是对聚合酶抑制剂产生抗性的变体。还提供涉及流感A病毒变体的方法和组合物。还提供分离、鉴定和表征来自患者的多种病毒变体的方法。

Influenza A virus variants

The present invention relates to influenza A virus variants, especially those that produce resistance to polymerase inhibitors. Methods and compositions for influenza A virus variants are also provided. Methods for the isolation, identification and characterization of a variety of viral variants from patients are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流感A病毒变体相关申请的交叉参考本PCT申请要求享有2014年10月2日提交的美国临时申请No.62/058,961的权益。通过参考将该临时申请的全部内容并入本申请。序列表通过提及将标题为“355615_ST25.txt”(8.06千字节)的序列表的全部内容并入本申请，该序列表生成于2014年10月2日并且电子提交。专利技术背景流感以季节性流行病在全世界传播，导致每年成千上万人死亡—在大流行年份导致数百万人死亡。例如，20世纪发生了3次流感大流行，导致数千万人死亡，这些大流行每次都是由在人类中所述病毒的新毒株的出现引起的。通常，这些新的病毒株由现有流感病毒从其它动物物种向人类的传播引起。流感主要通过被感染的人咳嗽或打喷嚏时产生的载有病毒的大液滴在人与人之间传播；然后这些大液滴可停留在靠近(例如，约6英尺内)被感染的人的易感个体的上呼吸道的粘膜表面。传播也可通过与呼吸道分泌物的直接接触或间接接触而发生，例如触摸被流感病毒污染的表面，然后触摸眼睛、鼻子或嘴。成人可能能够在出现症状前1天至症状开始后约5天将流感传播给他人。小孩和免疫系统弱化的人可能在症状发作后10天或更长时间具有传染性。流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒，正粘病毒科包括5个属：流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)和托高土(Thogoto)病毒。流感病毒A属有1个种，即流感A病毒。野生水鸟是大量流感A的天然宿主。有时，病毒传播至其它物种，然后可在家禽中引起毁灭性爆发或导致人类流感大流行。在所述3种流感类型中，A型病毒是最具毒性的人类病原体并且造成最严重的疾病。根据对这些病毒的抗体反应，可将流感A病毒细分为不同血清型。以已知人类大流行死亡数排序，已在人类中得到确认的血清型为：H1N1(其引起1918年西班牙流感)、H2N2(其引起1957年亚洲流感)、H3N2(其引起1968年香港流感)、H5N1(2007-2008流感季的大流行威胁)、H7N7(具有不常见的动物传染病潜能)、H1N2(人类和猪中的地方性流行)、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7。流感病毒B属有1个种，即流感B病毒。流感B几乎专感染人类并且比流感A更不常见。已知易受流感B感染的唯一另一种动物是海豹。这种类型的流感按照比A型慢2～3倍的速率突变，因此遗传多样性较低，仅有一种流感B血清型。由于这种抗原多样性的缺乏，通常在早年获得一定程度对流感B的免疫力。然而，流感B突变足以使得持久免疫不可能。这种降低的抗原变化速率，结合其受限宿主范围(抑制跨物种抗原转变)，确保不会发生流感B大流行。流感病毒C属有1个种，即流感C病毒，其感染人类和猪并且可引起严重疾病和局部流行病。然而，流感C与其它类型流感相比较不常见并且通常似乎引起儿童的轻度疾病。流感A、B和C病毒在结构上非常相似。病毒颗粒直径为80～120纳米并且通常近似球体，尽管可能出现丝状形式。对于病毒而言不同寻常的是，其基因组并非一条核酸；相反，它含有7或8条片段化的负义RNA。流感A基因组编码11种蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。HA和NA是位于病毒颗粒外部的大糖蛋白。HA是介导病毒结合靶细胞和病毒基因组进入靶细胞的凝集素，而NA涉及通过裂解与成熟病毒颗粒结合的糖而从感染细胞释放子代病毒。因此，这些蛋白质已成为抗病毒药物的靶标。而且，这些蛋白质是可以产生抗体的抗原。根据对HA和NA的抗体反应，将流感A病毒分为亚型，形成例如H5N1中H和N区别的基础(参见上文)。流感产生由丧失生产力和相关医学治疗导致的直接成本，以及预防措施的间接成本。在美国，流感是造成每年超过100亿美元总成本的原因，尽管据估计未来的大流行可引起数千亿美元的直接和间接成本。预防性成本也很高。世界各国政府已花费了数十亿美元为可能的H5N1禽流感大流行做准备和计划，成本与购买药物和疫苗以及开展灾难演习和改善边境控制的策略相关。目前对流感的治疗选择包括接种疫苗和用抗病毒药物进行化学治疗或化学预防。常常向高危群体，例如儿童和老年人，或有哮喘、糖尿病或心脏病的人推荐接种抗流感的流感疫苗。然而，接种了疫苗但仍得流感是可能的。每个季节对一些特异性流感株的重新配制疫苗，但它不可能包括该季节世界上有效感染人的所有病毒株。生产厂商配制并生产处理季节性流行所需的数百万份剂量需要约6个月；有时，新的或被忽视的病毒株在这期间变得显著并感染人群，虽然这些人群已经接种疫苗(如2003—2004流感季H3N2福建流感)。还有可能的是，在接种疫苗之前刚被感染并且所得的病正好是感染假定疫苗预防的病毒株，因为疫苗起效需要约两周。另外，这些流感疫苗的有效性是可变的。由于病毒的突变速率高，特定流感疫苗赋予的保护通常不超过几年。因为流感病毒随时间快速变化，并且不同病毒株成为优势，为一年配制的疫苗在下一年可能无效。此外，因为缺乏RNA校读酶，流感vRNA的RNA依赖性RNA聚合酶大约每1万个核苷酸(这是流感vRNA的近似长度)产生一个核苷酸插入错误。因此，几乎每种新生产的流感病毒均为突变-抗原漂移体。如果超过一个病毒系感染了单个细胞，则基因组分离为8个单独的vRNA片段使得vRNA混合或重配。所产生的病毒遗传学上的快速变化产生抗原漂移并且使病毒感染新宿主物种并迅速克服保护性免疫性。抗病毒药物也可用于治疗流感，神经氨酸酶抑制剂尤其有效，但病毒可对标准抗病毒药物产生抗药性。因此，仍然需要用于治疗流感感染的药物，例如具有扩大的治疗窗和/或对病毒滴度的敏感性降低的药物。因此，在鉴定突变的流感A病毒或对药物或其它疗法显示抗性的其它病毒方面以及在开发对这些突变的病毒有效的新的病毒治疗剂方面存在需求。专利技术概述因此，本专利技术提供流感A病毒变体，以及相关的方法和组合物。特别地，提供对一种或多种聚合酶抑制剂的敏感性降低的流感A病毒变体和变体流感A病毒聚合酶。在一方面，本专利技术提供分离的流感A病毒多核苷酸、其生物活性类似物或其生物活性片段，其包含编码流感A病毒聚合酶的基因中的突变，其中所述的突变导致对应于选自由野生型流感A病毒的第306、323、324、363、376、404、431和510位氨基酸组成的组的氨基酸残基的至少一个氨基酸替代。在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸，其不编码Q。在一些实施方案中，所述核苷酸编码H或L。在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸，其不编码F。在一些实施方案中，所述核苷酸编码S或Y。在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸，其不编码S。在一些实施方案中，所述核苷酸编码G、I、N或R。在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第337位氨基酸的核苷酸，其不编码S。在一些实施方案中，所述核苷酸编码L或P。在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的流感A病毒多核苷酸、其生物活性类似物或其生物活性片段，它包含编码流感A病毒聚合酶的基因中的突变，其中所述的突变导致至少一个氨基酸替代，其对应于选自由野生型流感A病毒的第306、323、324、337、363、376、404、431和510位氨基酸组成的组的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.02 US 62/058,9611.分离的流感A病毒多核苷酸、其生物活性类似物或其生物活性片段，它包含编码流感A病毒聚合酶的基因中的突变，其中所述的突变导致至少一个氨基酸替代，其对应于选自由野生型流感A病毒的第306、323、324、337、363、376、404、431和510位氨基酸组成的组的氨基酸残基。2.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸不编码Q。3.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸编码H。4.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸编码L。5.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸不编码F。6.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸编码S。7.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸编码Y。8.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸不编码S。9.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码G。10.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码I。11.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码N。12.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码R。13.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第337位氨基酸的核苷酸不编码S。14.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第337位氨基酸的核苷酸编码L。15.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第337位氨基酸的核苷酸编码P。16.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第363位氨基酸的核苷酸不编码F。17.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第363位氨基酸的核苷酸编码L。18.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸不编码K。19.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸编码N。20.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸编码Q。21.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸编码R。22.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第404位氨基酸的核苷酸不编码F。23.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第404位氨基酸的核苷酸编码Y。24.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸不编码M。25.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸编码I。26.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸编码T。27.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸不编码N。28.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸编码T。29.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸编码K。30.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于选自由第306、323、324、337、363、376、404、431和510位氨基酸组成的组的任意2个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码不同于相应野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸的氨基酸。31.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于选自由306、323、324、337、363、376、404、431和510位氨基酸组成的组的任意3个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码不同于相应野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸的氨基酸。32.分离的流感A病毒聚合酶，它包含氨基酸序列，其中在选自由306、323、324、337、363、376、404、431和510组成的组的至...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·R·里曼，R·伯恩，H·B·本奈特，D·J·巴特尔斯，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US