本发明专利技术涉及基因工程领域，具体是红花CtCHS1基因、其编码蛋白质及在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。本发明专利技术还提供通过花粉管通道培育转基因红花的方法。本发明专利技术首次提供了红花CtCHS1参与红花黄酮生物合成途径相关基因的调控，CtCHS1通过转基因的方法转入红花中，可以刺激上游基因的表达，抑制下游基因的表达，同时，可以提高醌式查尔酮类化合物的含量。
Safflower CtCHS1 gene, its coding protein and Application
The invention relates to the field of gene engineering, in particular to the safflower CtCHS1 gene, its coding protein and its application in improving the content of flavonoids in Carthamus tinctorius. The invention also provides a method for culturing transgenic safflower through a pollen tube passage. The present invention provides the first regulation of safflower CtCHS1 genes of safflower flavone biosynthesis pathway, CtCHS1 through transgenic methods to safflower, can stimulate the expression of the upstream gene, expression, inhibition of downstream genes at the same time, can improve the content of quinone chalcone compounds.
【技术实现步骤摘要】
红花CtCHS1基因、其编码蛋白质及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，是红花CtCHS1基因、其编码蛋白质及应用。
技术介绍
传统中药红花(CarthamiFlos)在本草中被认为具有活血祛瘀，通经活络的功效，其主要成分为黄酮类化合物，羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin、槲皮素及其苷类、山萘酚及其苷类被认为是其发挥药理活性的主要活性成分[]。因此，通过红花黄酮代谢通道关键基因的调控是提高红花黄酮含量的一种有效方法。查尔酮合酶是III型聚酮类化合物合酶超家族中的一员，它可以催化1分子的4-香豆酰-COA(p-coumaryl-COA)和3分子的丙二酰-COA(malonyl-COA)，发生缩合反应，生成黄酮类化合物的前体査尔酮。研究表明，它参与很多天然产物的生物合成，尤其是黄酮类化合物，被认为是黄酮代谢途径中的关键酶。而且，查尔酮合酶参与植物体的一系列生化进程，如色素形成，雄性不育以及对抗外界刺激等。花粉管通道法在1983年被我国学者周光宇第一次提出，目前，该技术已经被应用在黄瓜，玉米等多种转基因农作物上。这个技术解决了开花植物组织再生率低的问题，而且操作简单稳定，尤其适用于药用植物红花这一类药用部位为花器官且组织再生率低的物种(Zhou,G.Weng,J.Zeng,Y.Huang,J.Qian,S.Liu,G.IntroductionofexogenousDNAintocottonembryos.MethodsEnzymol.1983,(101):433-481.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供红花CtCHS1基因的核苷酸序列及其编码蛋白和应用。本专利技术的第一方面，提供一种红花CtCHS1(查尔酮合酶)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的CtCHS1基因全长1487bp，其开放阅读框(ORF，OpenReadingFrame)区包含了1194bp，编码397个氨基酸，开放阅读框的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二方面，提供一种红花CtCHS1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三方面，提供一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有上述红花CtCHS1基因SEQIDNO.1或其开放阅读框SEQIDNO.3。优选的，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtCHS1基因的引物对为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5：CtCHS1F-LIC:GGAAGGATTTCACATATGTCCATGGCATCCTTAACCGATAT(SEQIDNO.4)CtCHS1R-LIC:ATTTAATTACCTGCAGGGCTTTCAGCGGCAATGGGGGTGG(SEQIDNO.5)。优选的，用于扩增红花CtCHS1基因开放阅读框的引物对为SEQIDNO.6和SEQIDNO.7：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGGCATCCTTAACCGATATTG(SEQIDNO.6)CATGGTGGCAAGCTTAGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAG(SEQIDNO.7)。优选的，所述的重组表达载体为植物表达载体。更优选质粒pMAL-c5x或真核表达载体pMT39。优选的，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选农杆菌LBA4404。本专利技术的第四方面，提供上述的红花CtCHS1基因在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。优选的，所述的红花CtCHS1基因提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin的含量。本专利技术的第五方面，提供上述的红花CtCHS1蛋白在提高红花中黄酮类化合物含量中的应用。优选的，所述的红花CtCHS1蛋白提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin的含量。本专利技术的第六方面，提供一种提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法，所述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法是将含有上述红花CtCHS1基因或其开放阅读框的重组菌采用花粉管通道法遗传转化红花。优选的，包括以下步骤：A、构建含有上述红花CtCHS1基因或其开放阅读框的重组表达载体；B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。更优选的，包括以下步骤：I、载体构建：设计无缝克隆引物扩增CtCHS1的ORF区，扩增引物为SEQIDNO.6和SEQIDNO.7，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体；II、农杆菌介导的转化，具体操作方法为：a.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗；b.将步骤I获得的重组载体用热击法转入农杆菌LBA4404中，在LB+卡那霉素+链霉素的培养基上进行筛选，PCR扩增得到阳性克隆菌液，在LB培养基大摇，至菌液浓度OD约为0.8；菌液5000prm，离心5分钟，弃去上清；c.用5％蔗糖溶液重悬，加入0.02％的表面活性剂silwet-77重悬；d.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境；e.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品；f.设计引物SEQIDNO.8和SEQIDNO.9进行基因组水平验证，筛选出转基因阳性植株。本专利技术的第七方面，提供一种采用上述的提高红花中黄酮类化合物含量的转基因方法获得的红花转基因植株或种质。本专利技术优点在于：本专利技术首次提供了红花CtCHS1参与红花黄酮生物合成途径相关基因的调控，CtCHS1通过转基因的方法转入红花中，可以刺激上游基因的表达，抑制下游基因的表达，同时，可以提高醌式查尔酮类化合物的含量。实验证明，过表达红花CtCHS1可以明显提高红花重要活性成分醌式查尔酮，如羟基红花黄色素A、carthamin的含量。附图说明图1.CtCHS1编码的氨基酸序列与其他物种中查尔酮合酶的同源比对结果。图2.CtCHS1编码的氨基酸序列与其他物种中查尔酮合酶的系统进化树分析。图3.CtCHS1所编码的蛋白质电泳结果，1：蛋白质分子marker；2：菌液中表达的蛋白质表达情况；3：纯化过后的融合蛋白条带；4：酶切过后的目的蛋白。图4为红花过表达CtCHS1的载体图谱。图5.过表达CtCHS1对黄酮生源途径基因的影响，WT：野生型；CK：空载处理组；OVX：过表达CtCHS1组。图6.过表达CtCHS1对黄酮生源途径代谢产物的影响，WT：野生型；CK：空载处理组；OVX：过表达CtCHS1组。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。所使用的实验方法若未特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所使用的材料，试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。红花为野生型云南巍山品种，种植于第二军医大学药学院温室。SMARTTMRACEc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种红花CtCHS1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种红花CtCHS1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的红花CtCHS1基因，其特征在于，所述的红花CtCHS1基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.一种红花CtCHS1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有红花CtCHS1基因SEQIDNO.1或其开放阅读框SEQIDNO.3。5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于，在制备所述的重组表达载体或重组菌时，用于扩增红花CtCHS1基因的引物对分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；用于扩增红花CtCHS1基因开放阅读框的引物对分别如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。6.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于，所述的重组表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭美丽，郭丹丹，何贝轩，贾鑫磊，薛英茹，刘飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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