一种厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS及其编码基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及工程菌酿酒酵母和植物分子生物学领域。本发明专利技术提供了厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS及其编码基因的应用。所述IpPCS基因，其cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的应用。本发明专利技术IpPCS基因编码的蛋白质厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS蛋白与酿酒酵母重金属镉的耐受和积累相关。通过构建IpPCS基因的酿酒酵母转基因超表达载体，将IpPCS基因在酵母中超表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性，并提高酵母中的镉含量，促进酵母体内镉的解毒。该基因可应用于工程菌及植物针对体内镉含量改变的遗传工程育种，用于环境重金属镉污染的微生物和植物修复领域。

Thick vine chelate peptide synthetase IpPCS and application of coding gene thereof

The present invention relates to the field of engineering bacteria, Saccharomyces cerevisiae and plant molecular biology. The present invention provides the application of a thick vine chelate peptide synthetase IpPCS and a coding gene thereof. The IpPCS gene, the cDNA reading frame sequence of SEQ ID NO.2 shows, application of its amino acid sequence encoding as shown in SEQ ID NO.1. The IpPCS gene encoding protein thick vine chelated peptide synthetase IpPCS protein is related to tolerance and accumulation of cadmium in Saccharomyces cerevisiae. The Saccharomyces cerevisiae transgenic over expression vector construction of IpPCS gene, IpPCS gene expression in yeast in yeast, can improve the tolerance to cadmium, and increase the cadmium content in yeast, yeast and promote CD detoxification. The gene can be applied to genetic engineering breeding of engineering bacteria and plants aiming at cadmium content change in the body, and is used in the field of microorganism and Phytoremediation in the environment of heavy metal cadmium pollution.

【技术实现步骤摘要】
一种厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS及其编码基因的应用
本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS基因及其编码蛋白在调控酵母镉耐受和镉积累方面的应用。
技术介绍
随着工业化的发展和城市化的推进，土壤重金属污染已成为不可忽视的突出环境问题。重金属污染不仅使土壤的组成、结构和功能发生变化，还能抑制农作物的生长和光合作用，导致作物减产至绝收。更为严重的是，重金属可能通过食物链进入动物、人体内，严重危害动物和人体的健康。近几十年来，由于沿海地区的城市化和工业化的快速发展，工农业和生活污水的不断排放，导致我国滨海地区污染现状十分严峻，其中，重金属污染状况尤为严重。国土资源部广州海洋地质调查局1998年起对我国沿海地区的调查显示，我国南方沿海海域水体和表层大多受到重金属的污染，局部污染程度较为严重。土壤是人类赖以生存的主要自然资源，而滨海地区也是土壤的重要组成部分。滨海地区不仅隐藏着重要的生物资源，同时也在维持沿海地区的生态与经济安全、美化环境方面也发挥着重要的作用。针对我国沿海地区受到严重的重金属污染这一现状，发掘适应于滨海环境的重金属富集植物，并将之应用于重金属污染的植物修复，从而对恢复和保持滨海地区生态环境具有重要的科学意义和潜在的应用价值。植物修复技术是一种新兴的环境修复技术，因其治理效果的永久性、治理成果的低廉性、环境美学的兼容性及金属元素可回收利用等优点成为重金属污染领域的一个研究热点。因此，发掘适应于我国滨海环境的重金属污染的修复植物，并研究其分子机制，对于进一步深入开发滨海环境重金属污染的植物修复技术奠定理论基础和提供借鉴。厚藤(Ipomoeapes-capraeL.)又名马鞍藤、二叶红薯、马蹄草，主要分布于热带和亚热带地区海边沙滩上及向阳的路边，是一种优良的的滨海适生野生植物资源。厚藤种子可通过在海水中漂浮扩散进行繁殖，其耐盐性极佳；厚藤叶片碧绿，花型美观艳丽，花期长，生长迅速，是一种优良的海滩地被植物；此外，厚藤还具有一定的药用价值，是一种重要的民间草药。有研究表明，在重金属污染的铅锌矿地区，野生厚藤对重金属镉的富集系数和转运系数均较高，表明厚藤对镉具有一定的富集能力，具备作为海滩重金属镉污染修复植物的基础。重金属污染是全球性环境问题，植物修复技术因其廉价、安全与环境友好的特点，给重金属污染环境的修复带来了新的希望。植物修复就是利用植物去除环境中的污染物或者将其转变成无毒及毒性较低的物质的过程。植物螯合肽(PCs，phytochelatins)是植物体内发现的非蛋白质小分子多肽，富含半胱氨酸，在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。植物螯合肽并非由基因编码而成，而是以谷胱甘肽为底物，通过植物螯合肽合成酶(PCS，phytochelatinsynthases，EC2.3.2.15)催化合成的。目前，植物螯合肽合成酶基因已经在多种植物中得以克隆，并有大量的研究表明该类基因在植物重金属螯合解毒过程中起重要作用。例如，拟南芥植物螯合肽合成酶基因AtPCS1在拟南芥和烟草中超表达，可以提高转基因植株对重金属Cd的耐受性，并响应地增加植物体内Cd的积累，有助于植物对外界环境中Cd的吸收和富集。烟草体内过量表达小麦TaPCS1基因，显著提高了烟草对重金属如Pb和Cd的抗性，同时转基因烟草地上部分富集的Pb是野生型的2倍。大蒜的植物螯合肽合成酶基因AsPCS导入因CUP基因缺失而对Cd敏感的酵母突变体中，酵母cup缺失突变菌株对Cd的耐受性提高了4倍。以上的研究表明，无论在植物体内，还是在工程菌酵母体内，植物螯合肽合成酶基因均可以提高生物体对外界重金属的耐受性，并改变体内重金属的积累。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一个厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS，及其编码基因IpPCS的应用。本专利技术的所阐述的厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，其编码基因IpPCS的cDNA阅读框核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。即所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种将上述厚藤植物螯合肽合成酶基因IpPCS应用于植物基因工程中，用于改变转基因植物对重金属镉的耐受和富集的可能性。本专利技术公开了厚藤植物螯合肽合成酶基因在镉胁迫下的诱导表达特征，表明了该基因参与重金属镉胁迫的应答及解毒。本专利技术采用realtimeRT-PCR的方法鉴定了一个厚藤植物螯合肽合成酶基因在重金属Cd胁迫下的表达特征，论证了该基因为厚藤体内应答重金属镉胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响植物体内镉积累和胁迫的候选功能基因。本专利技术的另一目的是公开一个酿酒酵母重组表达载体，该重组载体插入了厚藤植物螯合肽合成酶基因IpPCS。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，能够在镉胁迫下，提高转基因酵母菌对重金属镉的耐受，并提高酵母细胞内镉积累。本专利技术以厚藤幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计以下引物分别扩增IpPCS基因的cDNA全长序列，用于获取插入至酿酒酵母表达载体pYES2的cDNA阅读框片。引物如SEQIDNO.3(IpPCSYEF：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGGCGATGGCAGGCCTTTAC-3’)和SEQIDNO.4(IpPCSYER：5’-TAGATGCATGCTCGAGCTAGCTCTCCCTGAAAAAAAG-3’)所示。以上PCR采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于酵母表达载体pYES2上(BamHI和XhoI之间)，形成重组载体IpPCS-pYES2，并测序。采用醋酸锂的方法将上述厚藤植物螯合肽合成酶重组载体转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基(添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化pYES2空载体的酵母菌株为对照，30℃培养酵母至OD600为1.5-2，用于检测转基因酵母菌对重金属镉胁迫的耐受性以及对镉积累的变化。本专利技术的另一目的是提供一种酿酒酵母工程菌株及其应用。所述酿酒酵母工程菌株转化有上述的酿酒酵母重组表达载体。该酿酒酵母工程菌株可应用在对环境中重金属镉污染的修复中。本专利技术的另一目的是提供一种提高厚藤中重金属镉耐受性的生物制剂。所述提高厚藤中重金属镉耐受性的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体或上述酿酒酵母，或其活性成份含有调控IpPCS基因表达的生物制品，所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种提高植物中重金属镉积累的生物制剂。所述提高植物中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体或上述酿酒酵母，或其活性成份含有调控IpPCS基因表达的生物制品，所述IpPC本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS和/或IpPCS基因在提高植物对重金属镉的耐受中的应用，所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2017.01.24 CN 20171005543981.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS和/或IpPCS基因在提高植物对重金属镉的耐受中的应用，所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的厚藤植物螯合肽合成酶IpPCS蛋白和/或IpPCS基因在提高植物对重金属镉的积累中的应用，所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。3.插入有IpPCS基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述IpPCS基因的cDNA阅读框为如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpPCS基因为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.1的核苷酸序列。4.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性中的应用。5.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高微生物工程菌株对重金属镉的积累中的应用。6.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张美，夏快飞，简曙光，郭艳，张会，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44