柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术的柔嫩艾美耳球虫基因，是柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的基因，与子孢子入侵宿主细胞相关，对开发抑制子孢子入侵宿主细胞、阻断球虫生活史的新疫苗或新药具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用。
技术介绍
鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要以在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使用一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。钙元素广泛的存在于自然界和各种生物体内，而游离态的Ca2+更是在生命活动中扮演着极其重要的角色，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动。在所有真核生物细胞中，钙离子(Ca2+)是细胞内一种重要的信号分子，作为第二信使在许多细胞和生理功能中发挥重要的作用。当细胞受到激素或电刺激后，胞浆内的Ca2+浓度升高，可引起细胞内的一系列生理反应。顶复器原虫是一种真核生物，需要入侵宿主细胞后在宿主细胞内生长、发育繁殖等，而Ca2+在顶复器原虫的整个生活史发育中起着不可缺少的作用，控制着许多重要生理过程，包括调控虫体蛋白的分泌、运动、分化及入侵和逃逸宿主细胞等，同样，Ca2+也控制着虫体在宿主细胞内的生长发育。虽然Ca2+在真核生物细胞的信号传导通路中发挥着重要功能，但细胞内Ca2+的浓度是瞬时变化的，聚集也是非常短暂的。Ca2+能否将信号快速准确的传递给下游分子，取决于与Ca2+结合的蛋白。因此，与Ca2+结合的蛋白在Ca2+信号通路中非常关键。在哺乳动物细胞中，蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)和钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(calcium/calmodiulindependentproteinkinase，CaMK)是Ca2+信号通路中重要的效应分子。但顶复器原虫体内缺少PKC，仅有少量的CaMK异构体，而代替这两类激酶的是另一类丝/苏氨酸激酶——钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependentproteinkinases，CDPKs),CDPKs是顶复器原虫体内最丰富的一类Ca2+依赖的激酶。CDPKs的全称是钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶或类似钙调素结构域的蛋白激酶(calmodulin-likedomainproteinkinases)，CDPKs是一个由多基因编码的大家族,它不同于哺乳动物细胞中的PKC和CaMK。迄今为止，仅在植物、绿藻、纤毛虫及顶复器原虫体内发现CDPKs，而在细菌、真菌、酵母、线虫和动物中尚未发现。已有研究表明：CDPKs是疟原虫和弓形虫Ca2+信号通路中重要的效应分子，不同的CDPKs表达具有虫体发育阶段特异性，控制许多至关重要的Ca2+依赖的生理过程，包括微线的分泌、细胞骨架的动力学和运动复合体的调控等，从而影响虫体的滑移运动、细胞入侵和逃逸、发育阶段的转化、分化繁殖等。目前对CDPKs在鸡球虫生活史中的功能还不是很清楚，有待作进一步研究，为研发新治疗药物和研制新型疫苗提供新思路。
技术实现思路
本专利技术要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(EtCDPK4)，该EtCDPK4在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫苗或新药具有很高的应用价值。此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(EtCDPK4)，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术利用5’RACE和3’RACE首次扩增了完整的EtCDPK4基因序列，该序列全长2499bp(SEQIDNO.1)，包括5’端的UTR序列，长185bp，3’端UTR序列，长511bp，含Ploy(A)尾，ORF长1803bp(186-1988bp)。其中5’-UTR和3’-UTR，可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5’UTR通过其长度和碱基顺序以及二级结构等来参与表达调控。其中5’-UTR主要参与翻译调节，影响转录后的各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用；3’-UTR影响RNA的水平，从而影响翻译后蛋白的表达量，因此，5’-UTR和3’-UTR在真核生物基因的转录、翻译和表达过程中发挥重要作用。在本专利技术的另一方面，提供了一种重组载体，包含编码柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4开放阅读框完整或部分氨基酸序列的核苷酸序列，所述开放阅读框完整氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。在本专利技术的另一方面，还提供了一种抗体，该抗体是用上述重组蛋白免疫动物而制得。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选预防或治疗球虫病的药物。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组蛋白的疫苗。在本专利技术的另一方面，还提供了一种作用靶标为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4的抗球虫药物。本专利技术柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(EtCDPK4)，是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)的一个新基因。免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示EtCDPK4与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本专利技术的EtCDPK4基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例2的EtCDPK4基因克隆及其原核表达系统构建结果图；图2是本专利技术实施例3的pColdI-EtCDPK4原核表达蛋白形式确定以及纯化结果图；图3是本专利技术实施例3抗EtCDPK4重组融合蛋白血清的WesternBlotting检测结果图；图4是本专利技术实施例4的EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫四个发育阶段转录水平高低的比较柱状图；图5是本专利技术实施例5的EtCDPK4酶活性的测定结果图；图6是本专利技术实施例6不同Ca2+浓度对EtCDPK4酶活性影响的定性检测实验结果图；图7是本专利技术实施例6不同Ca2+浓度对EtCDPK4酶活性影响的定量检测实验结果图；图8是本专利技术实施例7的EtCDPK4的7种特异性抑制剂筛选的定性反应检测结果图；图9是本专利技术实施例7的EtCDPK4的7种特异性抑制剂筛选的定量反应的显著性差异分析图；图10是本专利技术实施例8的Ant本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种重组载体，其特征在于，包含编码柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4开放阅读框完整或部分氨基酸序列的核苷酸序列，所述开放阅读框完整氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求2所述重组载体经表达而制得。4.一种抗体，其特征在于，该抗体是用权利要求3所述重组蛋白免疫动物而制得。5.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩红玉，黄兵，王自文，董辉，赵其平，朱顺海，李聪，朱雪龙，夏伟丽，门启斐，唐敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31